Novel routes of hydroperoxide detoxification in Mycobacterium tuberculosis

Drug resistance and virulence of M. tuberculosis are in part related to the pathogen's antioxidant defense systems. KatG strains are resistant to the first line tuberculostatic isoniazid but they need to compensate their catalase deficiency by alternative peroxidase systems to remain virulent. So far only NADH-driven and AhpD-mediated hydroperoxide reduction by AhpC has been implicated as such a virulence-determining mechanism. In search of more likely metabolic links of AhpC, the genome of M. tuberculosis was screened for homologues of AhpF, thioredoxin-related proteins and peroxiredoxins. The genes were expressed heterologously in E. coli or M. smegmatis and purified to homogeneity. By means of those tools, two novel pathways were discovered that underscore the importance of the thioredoxin system for antioxidant defense in M. tuberculosis. They are: (1) NADPH-driven hydroperoxide reduction by AhpC that is mediated by thioredoxin reductase and thioredoxin C and (2) hydroperoxide reduction by the atypical peroxiredoxin TPx that equally depends on thioredoxin reductase but can use both thioredoxin B and C. According to kinetic analyses of hydroperoxide and peroxynitrite reduction and estimated enzyme levels, the redox cascade comprising thioredoxin reductase, thioredoxin C and TPx should be the most efficient system in situ to protect M. tuberculosis against oxidative and nitrosative stress.Antibiotika-Resistenz und Virulenz von Mycobacterium tuberculosis sind teilweise mit den antioxidativen Verteidigungssystemen des Pathogens verknüpft. KatG-Stämme sind Isoniazid-resistent. Sie müssen den KatG-Verlust durch alternative Peroxidase-Systeme ausgleichen, um ihre Virulenz erhalten zu können. Bisher ist nur ein NADH-gespeistes AhpD- vermitteltes Hydroperoxid-Reduktionssystem durch AhpC bekannt. Auf der Suche nach wahrscheinlicheren Reaktionspartnern der AhpC und weiteren Peroxidase-Systemen wurden in der vorliegenden Arbeit eine Vielzahl mykobakerieller Gene kloniert, heterolog exprimiert und durch funktionelle Analyse der isolierten Genprodukte auf Relevanz für den mykobakteriellen Peroxid-Stoffwechsel getestet. Die Auswahl der untersuchten Gene basierte auf bioinformatischen Homologie- bzw. Analogie-Analysen. In vitro Rekombination der Genprodukte ergab zwei neuartige Redoxkaskaden, die die Relevanz des Thioredoxin-Systems in Mykobakterien unterstreichen. Diese sind: 1. NADPH-abhängige Hydroperoxid-Reduktion durch AhpC, die durch TrxC und Thioredoxin-Reduktase vermittelt wird und 2. Hydroperoxid-Reduktion durch das atypische Peroxiredoxin TPx, die ebenfalls Thioredoxin-Reduktase- und TrxC- oder TrxB- vermittelt ist. Nach Maßgabe von in-vivo-Konzentrationen der beteiligten Enzyme und deren kinetischer Effizienz, ist der zweite beschriebene Weg der mykobakteriellen Peroxid- Detoxifikation in situ als maßgeblich einzustufen, um M. tuberculosis gegen oxidativen und nitrosativen Stress zu schützen