Establishing of ES cell lines for a predictable autoregulated expression of transgenes in mice

Die meisten derzeit angewandten Verfahren zur Etablierung transgener Mäuse erfordern ein weitläufiges Screening von Tieren, da die zufällige Integration eines Transgens zu einer, vom Integrationsort abhängigen und daher nicht vorhersagbaren Transgen-Expression führt. Die Wiederverwendung von geeigneten Genorten in ES-Zellen zur Etablierung transgener Mäuse scheint daher sinnvoll. Zu diesem Zweck wurden autoregulierte Expressionskassetten, basierend auf dem TetOff-, TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-System, konstruiert, die eine Identifizierung regulierbarer Genorte im Mausgenom und deren Wiederverwendung für eine vorhersagbare, regulierte Expression eines beliebigen Transgens ermöglichen sollten. Die Expressionskapazitäten der Systeme wurden in verschiedenen ES-Zelllinien analysiert. Dabei zeigte sich, dass das TetOn-System ein sehr hohes, das TetOff-System jedoch nur ein niedriges Expressionspotential besitzt. In NIH3T3- und in in vitro differenzierten Zellen wurden jedoch hohe Expressionen mit dem TetOff-System erzielt. Auf der Basis Flp-vermittelter Rekombination wurde eine Kassettenaustauschstrategie entwickelt, die eine Integration eines Transgen-exprimierenden Konstruktes in bereits charakterisierte Genorte, die mit heterospezifischen FRT-Sites markiert sind, erlauben sollte. Diese Strategie wurde in NIH3T3-Zellen getestet und führte zu Zelllinien mit homogener, vorhersagbarer Transgen-Expression.Most of the current procedures for generating transgenic mice require a large scale screening of animals, since random integration of the transgene into the mouse genome results in integration site specific and thus unpredictable transgene expression. The reuse of appropriate integration sites in mouse ES cells for creation of transgenic mice seems to overcome these problems. For this purpose, autoregulated expression cassettes, based on the TetOff, TetOn, E.REXOff and PIPOff system, were designed for screening the mouse genome for inducible chromosomal sites and subsequent reuse of these sites by Flp-mediated recombination for a predictable and regulatable expression of any gene. The expression capacities of these systems were analyzed in different ES cell lines resulting in the observation that the TetOn systems has a very high and the TetOff system only a poor expression potential. However, with the TetOff system high expressions were realized in NIH3T3 cells and in in vitro differentiated cells. For the reuse of transgenic cells a cassette exchange strategy was evolved which should allow the efficient integration of a target construct in a precharacterized locus tagged with heterospecific FRT sites. This strategy was testet in NIH3T3 cells leading to cell lines with homogenous, predictable transgene expression