Towards a second generation of Salmonella-mediated oral DNA vaccines

Salmonella-mediated oral DNA vaccination has established itself as a very potent and versatile way of immunization. In this method, the use of commercially available multicopy expression plasmids based on pUC origin of replication (ori) transferred by the metabolic mutant Salmonella typhimurium aroA to mice has resulted in protective responses against pathogens and tumors. However, general applicability of this system has been hampered by a severe instability of transformants carrying these expression plasmids. Therefore new low copy number expression plasmids were constructed using different oris to stabilize the transformants. Comparative studies between transformants of the high copy number plasmid pCMVß and the different low copy number plasmids that contain the pMB1, p15A or pSC101 ori on the pCMVß backbone, revealed a dramatic increase in plasmid stability in vitro and in vivo. Analyzing the immune responses against antigens encoded by these vectors indicated that the increased stability resulted in a strong and reproducible induction of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell as well as antibody responses even after a single application. In protection studies using listeriolysin as antigen, mice were protected against a high lethal dose of Listeria monocytogenes independent of the plasmid copy number. Thus, we consider the improved stability as a first step towards a second generation of Salmonella-based oral DNA vaccines. In addition, it was shown that Salmonella transferring two independent antigens on these compatible low copy number plasmids elicited robust responses to either antigen that is effective as Salmonella transformed with each plasmid singly.Die Salmonellen-vermittelte orale DNA Vakzinierung hat sich bereits als eine sehr wirkungsvolle und vielseitige Art der Immunisierung etabliert. Bei dieser Methode werden kommerziell verfügbare Multicopy-Expressionsplasmide auf der Basis des pUC Replikationsursprunges (ori) mittels der Stoffwechselmutante Salmonella typhimurium aroA in Wirtszellen übertragen und sowohl schützende Immunantworten gegen Pathogene als auch gegen Tumore ausgelöst. Allerdings wird derzeit eine generelle Anwendung dieses Systems durch eine starke Instabilität der Transformanten, die solche Multicopy-Expressionsplasmide tragen, verhindert. Um die Transformanten zu stabilisieren wurden neue Plasmide konstruiert, deren Kopienzahl durch Einführung verschiedener ori´s reduziert wurden. Die Analyse der Transformanten mit den verschiedenen neuen Plasmiden niedriger Kopienzahl, die den pMB1, p15A oder pSC101 ori auf dem Hintergrund des ursprünglichen Multicopy-Plasmids pCMVß enthalten, zeigten eine extreme Verbesserung der Plasmidstabilität in vitro und in vivo gegenüber pCMVß. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung der Immunantworten gegen Antigene, die von diesen Vektoren kodiert wurden, dass eine verbesserte Stabilität auch in einer stärkeren und reproduzierbaren Induktion Antigen spezifischer CD4+ und CD8+-T-Zellen sowie Antikörperantworten schon nach einer einmaligen Anwendung resultierte. In Protektionsstudien, in denen Listeriolysin als Antigen verwendet wurde, waren Mäuse gegen eine hohe lethale Dosis von Listeria monocytogenes geschützt, unabhängig davon, ob die Salmonellen ein Plasmid hoher oder niedriger Kopienzahl tragen. Deswegen betrachten wir die verbesserte Stabilität als einen ersten Schritt in Richtung der zweiten Generation Salmonellen-basierter Vakzine. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Übertragung von zwei unabhängigen Antigenen, die auf diesen kompatiblen Plasmiden niedriger Kopienzahl kodiert sind, eine robuste Immunantwort gegen beide Antigene hervorrufen, die genauso gut ist wie Salmonellen die mit einem einzelnen Plasmid transformiert sind