Establishment of a transformation system for the medicinal plant Hypericum perforatum L.

Das Tüpfel-Johanniskraut (Hypericum perforatum) ist eine schon seit der Antike bekannte Heilpflanze mit vielfältigen pharmakologischen Eigenschaften. Seine Extrakte sind heute fester Bestandteil der Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen. Als Hauptwirkstoff gilt das mehrfach prenylierte bizyklische Acylphloroglucinol-Derivat Hyperforin, dessen Biosynthese noch weitgehend ungeklärt ist. Bislang sind lediglich die Synthese des Grundgerüsts und die erste der darauffolgenden Prenylierungsreaktionen biochemisch aufgeklärt. Die Bildung des Grundgerüsts Phlorisobutyrophenon geschieht unter Kondensation von Acetyl-Einheiten aus Malonyl-CoA an das Startersubstrat Isobutyryl-CoA unter Katalyse der Isobutyrophenon-Synthase. Mit Hilfe der Gentechnik soll die Biosynthese manipuliert und somit die Bildung Hyperforin-ähnlicher Substanzen erreicht werden. Für die Transformation des Johanniskrauts wurden verschiedene Methoden herangezogen. Zunächst wurde der Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentransfer eingesetzt. Neben unterschiedlichen Variationen der Blattscheibentransformation erfolgte auch die Infiltration intakter Blätter. Trotz vieler Modifikationen der Kulturbedingungen und des Einsatzes unterschiedlicher Ausgangsmaterialien gelang keine Transformation mit Agrobakterien. Es konnte gezeigt werden, dass Hypericum-Extrakte hemmend auf die gram-negativen Bakterien wirken. Da auch die Transformation von Protoplasten nicht zur Expression führte, erfolgte der Beschuss von Pflanzenmaterial mittels Partikelkanone. Die Expression eines Fusionsgens aus BPS und GFP konnte im Cytoplasma von Tabak-Blättern dargestellt werden. In Zellen einer Suspensionskultur der Hypericum-Varietät Helos gelang reproduzierbar die transiente Expression eines GFP-PTS1-Konstrukts in den Peroxisomen. Zudem konnten aus untransformierten Zellen dieser Kultur intakte Sprosse regeneriert werden.St. John's wort (Hypericum perforatum) is a well known medicinal plant since the antiquity. Its extracts exhibit various pharmacological activities and are nowadays a firm component of the treatment of mild to moderate depression. The main active compound appears to be the bicyclic polyprenylated acylphloroglucinol derivative hyperforin, whose biosynthesis is still largely open. So far only two steps, the formation of the core structure and the first reaction in the prenylation sequence, are biochemically characterised. The formation of the acylphloroglucinol skeleton proceeds via condensation of three acetyl-units from malony-CoA to the starter substrate isobutyryl-CoA. This reaction is catalysed by isobutyrophenone synthase. Genetic engineering of the hyperforin biosynthetic pathway might lead to the generation of hyperforin-like compounds. Different methods were used to transform St. John's wort, starting with the Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Various leaf disc transformations and the infiltration of intact leaves were carried out. Despite many modifications of the culture conditions and the use of different starting materials, no transformation was achieved with agrobacteria. It was demonstrated that H. perforatum extracts inhibited the growth of the gram negative bacteria. Since the transformation of protoplasts also failed to give the desired expression, the bombardment of plant material by means of a particle delivery system was carried out. The expression of a fusion gene consisting of BPS and GFP was demonstrated in the cytoplasm of tobacco leaves. In suspension-cultured cells of the H. perforatum variety Helos, the expression of a GFP-PTS1 construct succeeded reproducibly. Furthermore, the regeneration of non-transformed shoots from these cultured cells was successful