Investigations to the biotechnical methionine production in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Development of a screening strategy

Die essentielle schwefelhaltige Aminosäure Methionin ist ein wichtiges Futtermitteladditiv in der Tierernährung. Neben der seit vielen Jahren etablierten chemischen Synthese ist noch kein biotechnisches Verfahren im industriellen Maßstab existent. Ein Wachstums- und Produktionsmedium für Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, das eine Methionin-Überproduktion ermöglicht, wurde entwickelt. Der Wildtyp von ATCC 13032 wurde mittels UV-Licht mutiert. Die aus der Literatur bekannte Methionin-Analoga-Selektionsstrategie zur Selektion von Methionin-Überproduzenten u.a. mit Hilfe von DL-Ethionin konnte in dieser Arbeit nicht reproduziert werden und wurde aus verschiedenen Gründen als ungeeignet verworfen. Vor diesem Hintergrund wurde ein schneller kostengünstiger mikrobiologischer Methionin-Nachweis mit Hilfe von E. coli B834 entwickelt, um in einem Pool von C. glutamicum Mutanten die Methionin-überproduzierenden Exemplare aufzufinden. Die Nachweisgrenze in Medium lag bei 10 mg/l und in Wasser bei 0,5 mg/l bei sehr hoher Reproduzierbarkeit. Der mikrobiologische Test wurde evaluiert und statistisch abgesichert. Dieses qualitative Vorscreening wurde durch die Entwicklung und Optimierung einer hochempfindlichen Aminosäure-Analytik (Nachweisgrenze 1 mg/l) mittels Gaschromatographie nach Derivatisierung mit Ethylchlorformiat (EZ:faast-Kit, Phenomenex) gestützt. Alle Arbeitsschritte der Screening-Prozedur sind automatisierbar (Robotertauglichkeit). Bei Nutzung von zwei Thermoshakern für je vier 96-well-Platten und der Arbeitskraft eines Mitarbeiters konnte pro Monat ein Durchsatz von 6000 Proben erzielt werden – begonnen mit der UV-Mutation von ATCC 13032 und abgeschlossen mit der Vermessung der Mutanten auf Methionin-Bildung. Die statistisch betrachtet geringe Anzahl von 20.000 untersuchten Mutanten (dominierend im Aminosäure-Spektrum: Alanin, Glycin, Valin, Glutaminsäure und Lysin) könnte der Grund dafür sein, warum kein Methionin-Überproduzent gefunden werden konnte.The essential sulphur-containing amino acid methionine is an important feed additive in the animal food. Beside the chemical synthesis established for years no biotechnical procedure is still existent in the industrial scale. A growth and production medium for Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 which allows a methionine overproduction was developed. The wild type strain ATCC 13032 was mutated by means of ultraviolet light. The methionine analogues selection strategy known from the literature to the selection of methionine overproducers among other things with the help of DL-Ethionine could not be reproduced in this work and was rejected for different reasons as inexpedient. Before this background a quick cheaper microbiological determination method for methionine was developed with the help of E. coli B834, around in a pool of C. glutamicum mutants to discover the methionine overproducing ones. The detection limit in medium was 10 mg / l and in water 0.5 mg / l with very high reproducibility. The microbiological test was evaluated and proved statistically. This qualitative pre-selection was supported by the development and optimisation of highly sensitive amino acid analysis (detection limit 1 mg / l) by means of gaschromatography after derivatization with ethylchlorformiate (EZ:faast-Kit, Phenomenex). All working steps of the screening procedure are automateable (robot suitability). With use of two thermo shakers for in each case four 96 well plates and one employee a highthroughput of 6000 tests a month could be achieved - started with the UV mutation of ATCC 13032 and finished with determination of methionine production. From a statistical point of view low number of 20,000 examined mutants (dominating in the amino acid spectrum: alanine, glycine, valine, glutamic acid and lysine) could be the reason for, why no overproducers of methionine could be found