Production and Evaluation of Ligand Sneaking-Antibody Fusion Proteins

Ligand Sneaking-Proteine sind Antikörperfusionsproteine, mit denen intrazelluläre Signaltransduktionswege moduliert werden sollen. Sie bestehen aus drei Komponenten: Der erste Teil besteht aus einem scFv-Antikörperfragment, mit dem das Protein an einen internalisierenden Zelloberflächenrezeptor bindet. Der zweite Teil besteht aus einer Translokationsdomäne, welche die Translokation des dritten Teils, der Effektordomäne, aus dem Endosom in das Zytoplasma vermittelt. Die Effektordomäne interagiert im Zytoplasma mit Komponenten des Signaltransduktionsweges, um diesen zu modulieren. In einer vorangegangenen Arbeit wurde ein Ligand Sneaking-Fusionsprotein aus einem gegen den Transferrinrezeptor CD71 gerichteten scFv-Antikörperfragment, der Translokationsdomäne ETA II aus dem Pseudomonas Exotoxin A und einer NEMO binding domain (NBD) aus dem humanen IkappaB Kinase 2 (IKK-2)-Protein als Effektordomäne entwickelt. NBD bindet intrazellulär an NEMO (NF-kappaB essential modulator), die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes, wodurch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB durch proinflammatorische Stimuli unterbrochen wird. Die Ausbeute bei der Produktion des Ligand Sneaking-Antikörperfusionsproteins durch Sekretion in das Periplasma von E. coli war sehr gering. In dieser Arbeit wurden die Ursachen dafür untersucht und mehrere Produktionsmethoden auf ihre Eignung für die Produktion des Fusionsproteins überprüft. Es konnten grundlegende Voraussetzungen für die Produktion von Ligand Sneaking-Antikörperfusionsproteinen geklärt werden. Es stellte sich heraus, dass sowohl der gewählte scFv-Klon als auch die verwendete NBD-Variante die Sekretion massiv behinderten. Durch Austausch des scFv-Antikörperfragmentes und der NBD-Variante im LS-Fusionsprotein gegen andere Varianten ließen sich Fusionsproteine durch Sekretion ins Periplasma von E. coli erfolgreich produzieren und aufreinigen. Das Protein band spezifisch an Zielzellen. Eine Reduktion der NF-kappaB-Aktivität konnte über einen zellbasierten Reporterassay allerdings nicht nachgewiesen werden, wofür eine geringe Affinität des alternativen scFv-Klons und die mangelnde Sensitivität des Assaysystems verantwortlich waren.The Ligand Sneaking concept aims at the manipulation of intracellular signal transduction pathways using antibody fusion proteins that consist of three parts. The first part is an scFv antibody fragment directed against an internalizing receptor on the surface of a target cell. The second part of the fusion protein is a translocation domain that is capable of translocating the third part of the fusion protein, an effector domain, from the endosome into the cytoplasm of the target cell. In the cytoplasm the effector domain interacts with components of the signal transduction pathway, thereby leading to its disruption or down-regulation. In a previous work a Ligand Sneaking fusion protein was developed that consisted of an scFv antibody fragment directed against the transferrin receptor CD71, the translocation domain ETA II derived from the Pseudomonas Exotoxin A and the NEMO binding domain (NBD) derived from the human IkappaB kinase (IKK) 2 protein as the effector domain that binds to the intracellular protein NEMO (NF-kappaB essential modulator). NEMO represents the regulatory subunit of the IKK complex. By binding of NBD to NEMO the formation of the native IKK complex is inhibited. The yield of Ligand Sneaking fusion proteins produced by secretion into the periplasm of E. coli was very low. In this work the potential of several production methods to yield functional fusion protein was evaluated and basic requirements for the production of Ligand Sneaking fusion proteins were identified. It was shown that the scFv antibody fragment and the NBD variant used in the original fusion protein were detrimental to secretion. New anti-CD71 scFv antibody fragments were isolated from phage display libraries und characterised. After exchange of both the scFv antibody fragment and the NBD variant originally used in the Ligand Sneaking fusion protein modified fusion proteins were successfully produced in E. coli and purified. The material specifically bound to target cells. However, using a cell based NF-kappaB activity reporter assay it was not possible to show a reduction of NF-kappaB-activity because of the low affinity of the alternative scFv antibody fragment and the low sensitivity of the assay system