Recombinant antibodyfragments for diagnostics of zoonoses

Salmonellen und Campylobacter gehören weltweit zu den wichtigsten Zoonoseerregern und verursachten zusammen 2007 allein Deutschland über 116.000 lebensmittelbedingte Infektionen beim Menschen. Die am häufigsten isolierten Stämme sind Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli und Campylobacter jejuni. Schweinefleisch zählt dabei zu den Hauptinfektionsquellen in Industrieländern. Ein in den letzten Jahren immer größes Problem ist die Entwicklung von multiresistenten Stämmen. Dies macht eine lückenlose und zuverlässige Diagnostik bereits im Erzeugerbetrieb erforderlich. Ziel dieser Arbeit war es, rekombinante Antikörperfragmente gegen die Membranproteine OmpD von Salmonella Thyphimurium, MompC von C. coli und MompJ von C. jejuni zu generieren. Diese Antikörperfragmente sollten anschließend in einem tierartübergreifenden kompetitiven ELISA zur Diagnostik eingesetzt werden. Aus einem subtraktiven Ganzzellpanning auf zwei Salmonellenstämmen konnten zwei scFv-Fragmente isoliert werden, die spezifisch an Salmonellen nicht aber an OmpD binden. Alternativ wurde OmpD, MompC und MompJ rekombinant in E. coli hergestellt und als Antigene zur Antikörperselektion eingesetzt. Es konnten fünf scFv-Klone gegen OmpD, fünf gegen MompC und ein scFv-Klon gegen MompJ isoliert werden. Die Spezifität der Antikörper wurde mittels ELISA und Western-Blot nachgewiesen. Außerdem wurden die Epitope und das Aggregierungsverhalten der Antikörperfragmente untersucht. Nach abgeschlossener Charakterisierung wurde die Eignung der isolierten scFv-Fragmente für den Einsatz im kompetitiven ELISA überprüft. Das scFv-Fragment TM43-E10 war in der Lage, bei Verwendung eines Salmonellen-positiven Schweineserums, im Vergleich zur Maximalwertkontrolle eine Signalreduzierung von 65 Prozent zu erzielen. Die in dieser Arbeit isolierten und charakterisierten Antikörperfragmente könnten somit für die Etablierung einer effektiven Diagnostik von Salmonellen und Campylobacter bedingten Zoonosen genutzt werden.Salmonella and Campylobacter spec. are the major pathogens causing zoonoses and elicited 116000 cases of foodborne infections in Germany in the year 2007. Salmonella serotype Typhimurium, Campylobacter coli, and Campylobacter jejuni are the most frequently isolated bacteria in these cases. Pork is the essential origin of infection in industrial countries. Because of the increasing number of multiresistant pathogens during the last decade a fast diagnostic without interruption is needed. The aim of this thesis was the isolation of recombinant antibody fragments against the outer membrane proteins OmpD of Salmonella serotype Typhimurium, MompC of Campylobacter coli, and MompJ of Campylobacter jejuni to establish a competitive ELISA for diagnostics. Two Salmonella serotype Typhimurium specific scFv clones were isolated by whole cell panning, but these clones unable to bind to OmpD. An alternative panning with the recombinant antigens OmpD, MompC and MompJ was performed under denaturing conditions. Overall, five scFv clones against OmpD, five scFv clones against MompC, and one clone binding to MompJ were isolated and characterised by ELISA, Western blot and size exclusion chro-matography. After characterisation, it was testet, if the scFv fragments were appropriate for competitive ELISA. When using Salmonella serotype Typhimurium positive serum the scFv fragment TM43-E10 was able to reduce the ELISA signal. The ELISA signal was reduced about 65 Prozent compared to the sample without serum. The scFv fragments isolated and characterised in this thesis could be applicable to establish an effective method for diagnostics of zoonoses caused by Salmonella serotype Typhimurium an Campylobacte