Development and characterization of organotypic cornea constructs with different epithelial cells for in vitro permeation und cytotoxicity studies

Untersuchungen zur Absorption und Verträglichkeit von Wirkstoffen und Arzneiformen zur Anwendung am Auge werden häufig an lebenden Tieren bzw. isolierten Tieraugen durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ausgehend von einem etablierten organotypischen humanen Cornea-Konstrukt ein vergleichbares Konstrukt mit unterschiedlichem Epithel zu entwickeln und die Eignung beider Modelle sowohl für Permeations- als auch für Zytotoxizitätsuntersuchungen zu zeigen. Der Aufbau der Konstrukte erfolgte schrittweise mit einer humanen Endothelzelllinie, zwei unterschiedlichen Epithelzelllinien und nativen cornealen Fibroblasten. Es wurde das Permeationsvermögen von drei Modellarzneistoffen (Timololhydrogenmaleat, Diclofenac-Na und Clindamycin-HCl) durch die humanen Cornea-Konstrukte bestimmt und mit der Permeation durch exzidierte humane Cornea verglichen. Des Weiteren wurden Zytotoxizitätsuntersuchungen mit den Modellsubstanzen und SDS durchgeführt. Die halbletalen Konzentrationen (LC50) der Stoffe für die Monolayer, die fertigen Konstrukte und alle Kultivierungsstadien wurden verglichen. Die Cornea-Konstrukte mit HCE-T-Epithel zeigten für Timololhydrogenmaleat eine deutlich höhere Permeationsbarriere gegenüber den Konstrukten mit CEPI-Epithel und dem humanen Gewebe. Die Permeationsuntersuchungen mit Diclofenac-Na und Clindamycin-HCl ergaben ein vergleichbares Permeationsverhalten durch beide Cornea-Konstrukt-Typen mit CEPI- und HCE-T-Epithel. Zytotoxizitätsstudien mit Timololhydrogenmaleat und Clindamycin-HCl zeigen, dass die beiden Konstrukte im Vergleich zu den jeweiligen Monolayern deutlich unempfindlicher waren. Die Empfindlichkeit für Diclofenac-Na war bei Konstrukten und Monolayern ähnlich hoch. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Eignung der entwickelten humanen Cornea-Konstrukte sowohl mit CEPI-, als auch mit HCE-T-Epithel als In-vitro-Modelle für Permeations- und Zytotoxizitätsuntersuchungen.In vitro studies of ocular drug absorption and tolerance are normally performed with excised animal corneas or corneal cell culture models. In the present study, we report the suitability of two complete organotypic human cornea constructs with different epithelia as an alternative to excised cornea for both in vitro permeation studies and cytotoxicity assays. The three-dimensional tissue construct was created step-by-step with immortalized human endothelial and two kinds of epithelial cells and native stromal cells. The transcorneal permeation of three model drugs (timolol maleate, diclofenac sodium and clindamycin hydrochloride) across the human cornea construct with HCE-T-epithelium was tested and compared with already established human cornea construct (HCC-CEPI) and excised human cornea. Also cytotoxicity studies were performed using the same model drugs and SDS. Lc50 values of monolayer cultures, complete cornea constructs, and their different cultivation steps were compared. The human cornea construct with HCE-T epithelium has better barrier properties for timolol maleate compared to the model with CEPI epithelium and excised human cornea. For clindamycin hydrochloride and diclofenac sodium the HCC-HCE-T showed similar permeation behaviour compared with HCC-CEPI and excised human cornea. Cytotoxicity studies with timolol maleate and clindamycin hydrochloride showed significantly higher lc50 values of both human cornea constructs than the lc50 values of monolayer cultures. However, for diclofenac sodium, the lc50 values of the HCCs were in the same range than the values of the monolayers. The human cornea construct with CEPI as well as with HCE-T-epithelium represents a promising tool for permeation and cytotoxicity studies