Development of cell-based tests for the detection of new unwanted effects of anthropogenic substances in water

Die etablierten Testmethoden der aquatischen Ökotoxikologie basieren meist auf Vitalitätsuntersuchungen von Testorganismen oder liefern Nachweise von z. B. hormonaktiven Substanzen. Dies erlaubt jedoch nur eine begrenzte Aussage über andere unerwünschte Wirkungen der in der Probe vorhandenen Stoffe. In der Umwelt werden in den letzten Jahren vermehrt pharmazeutische Substanzen wie Entzündungshemmer gefunden. Ziel der durchgeführten Untersuchungen war daher, Testsysteme zu entwickeln, mit denen sowohl nicht akut-toxische als auch spezifische Effekte der Medikamente detektiert werden können. Als Basis der Testsysteme wurden murine Makrophagen sowie humane Lungenepithelzellen gewählt. Durch Zugabe von Endotoxinen oder Zytokinen lässt sich in diesen an der Immunantwort beteiligten Zellen der NF-κB Signalweg wie bei einer Entzündungsreaktion aktivieren. Zusätzlich wurden die Epithelzellen stabil mit einem NF-κB-Reporterplasmid transfiziert, so dass die Aktivierung von NF-κB direkt nachgewiesen werden konnte. Durch Zugabe von ausgewählten Pharmazeutika, definierten Mischungen oder Wasserproben konnten so die Effekte der Substanzen auf die NF-κB-Signalkaskade anhand der gebildeten Proteine untersucht werden. Außerdem sollten Genexpressionsanalysen einen umfassenden Überblick der Regulation von 84 NF-κB assoziierten Genen liefern. Mit Hilfe der Testsysteme konnten für zehn verschiedene Pharmazeutika keine Effekte auf die NF-κB-Aktivierung in umweltrelevanten Konzentrationsbereichen detektiert werden. Native Wasserproben aktivierten den Signalweg, was aber auf die Anwesenheit von Endotoxinen und/oder deren Bestandteile zurückgeführt werden konnte. Die Genexpressionsdaten zeigten kein Auffälligkeiten. Die grundsätzliche Funktionalität der Testsysteme konnte jedoch gezeigt werden, so dass eine Anwendung in der Umweltanalytik nach notwendigen Optimierungen möglich ist.The existing test methods in the field of aquatic eco-toxicology are mostly based on the analysis of vitality of test organisms or on the detection of hormonally active substances. However, these tests only allow a limited statement concerning unwanted effects of the sample. The most common compounds found in the environment are pharmaceutical substances such as anti-inflammatory drugs. The aim of these studies has therefore been to develop test systems with which both non-acute toxicity and specific effects of the drugs themselves can be detected. Murine macrophages and human lung epithelial cells were chosen as model test systems. The addition of endotoxins or cytokines activates the NF-κB signalling pathway in these cells which are involved in immune system reactions. Additionally, the epithelial cells were stably transfected with a reporter plasmid in order to show the activation of NF-κB directly. The addition of selected pharmaceuticals, defined mixtures or native water samples enabled an examination of the effects of the substances on the NF-κB signalling cascade via an analysis of the newly formed proteins. Furthermore, gene expression analysis gave an overview of the regulation of 84 NF-κB-associated genes. No effects on the activation of NF-κB could be observed for ten different pharmaceuticals in environmentally relevant concentrations. Native water samples activated the signalling pathway but this was attributable to the presence of endotoxins and/or their components. The gene expression data did not reveal any distinctive features. Thus, although the test systems are functional in principle, their application to environmental analyses will only be possible after further optimisation