Die Aminolävulinsäure Synthase aus Rhodobacter capsulatus

Aminolevulinic acid synthase (ALAS) is the initial enzyme of heme biosynthesis in humans, animals and some bacteria. It catalyzes the condensation of succinyl-CoA and glycine to yield aminolevulinic acid (ALA), Coenzyme A and CO2. To clarify details of its catalytic mechanism thirteen Rhodobacter capsulatus ALAS (ALASRc) variants were generated, purified and kinetically characterized. Variants of ALASRc for trapping the second intermediate in the ALAS reaction mechanism, 2-amino-3-ketoadipate, in cysteine-free ALAS background were generated. By performing single turnover experiments we were able to detect the second quinonoid. With the reaction with O-methylglycine we verified the occurrence of the first quinonoid as a clear indication for the presence of ketoadipate intermediate. Additionally, crystallization and initial X-ray diffraction experiments were carried out. Another focus was on the binding and supply of the succinyl-CoA substrate. Amino acid residues interacting with the carboxylate group of succinyl-CoA were exchanged. The results of stopped-flow kinetic analyses indicated that the residues R21, T83, N85 and I86 play a pivotal role in binding of the succinyl-CoA carboxylate group and contribute to a slow ALA release. Substrate analog studies revealed the strict specificity of wild-type ALASRc for its substrates glycine and succinyl-CoA. Interestingly, acyl-CoA derivatives sustained partial ALAS acitivity indicating a less strong discrimination. The contribution of T365-ALASRc catalysis localized on the dynamic loop region between the amino acids 358-374 of the C-terminal domain was investigated. Mutant enzymes were generated and first results indicate that the conformational change of the ALAS enzyme was due to succinyl-CoA binding. Finally, amino acid residues which were proposed to be responsible for the interaction with the β-subunit of the succinyl-Coenzyme A synthetase (βSCS) were exchanged and stand by for interaction studies. In summing crucial steps of ALAS catalysis, investigated with a combined kinetic and structural biology approach using mutant enzyme variants, were elucidated at the molecular level.Die Aminolävulinsäure Synthase (ALAS) ist das erste Enzym der Hämbiosynthese in Menschen, Tieren und einigen Bakterien. Es katalysiert die Kondensation von Succinyl-CoA und Glycin, was Aminolävulinsäure (ALA), Coenzym A und CO2 ergibt. Um Details seines katalytischen Mechanismus aufzuklären, wurden dreizehn Rhodobacter capsulatus ALAS (ALASRc) Varianten entwickelt, gereinigt und kinetisch charakterisiert. Varianten von ALASRc für das Einfangen des zweiten Zwischenproduktes im ALAS Reaktionsmechanismus, 2-Amino-3-ketoadipate, wurden in einem Cystein-freien Hintergrund entwickelt. Durch die Durchführung von Single Turnover Experimenten waren wir in der Lage das zweite Quinonoid zu detektieren. Mit der Reaktion mit O-Methylglycin bewiesen wir das Vorkommen des ersten Quinonoids als ein klarer Hinweis für das Vorhandensein des Ketoadipat-Zwischenproduktes. Zusätzliche wurden Kristallisations- und erste Röntgenstrahlbeugungsexperimente durchgeführt. Ein anderer Schwerpunkt lag auf der Bindung und Bereitstellung des Succinyl-CoA-Substrates. Aminosäurereste, die mit der Carboxylatgruppe des Succinyl-CoA interagieren, wurden ausgetauscht. Die Ergebnisse von Stopped-flow Kinetikanalysen deuten darauf hin, dass die Reste R21, T83, N85 und I86 eine entscheidende Rolle bei der Bindung der Succinyl-CoA Carboxylatgruppe spielen und zu einer langsamen ALA-Freisetzung beitragen. Studien mit Substratanaloga offenbarten die strikte Spezifität des Wildtyp ALASRc für seine Substrate Glycin und Succinyl-CoA. Interessanterweise, hielten Acyl-CoA-Derivate nur eine teilweise ALAS-Aktivität aufrecht, was auf eine weniger starke Diskriminierung hindeutet. Die Beteiligung von T365-ALASRc zur Katalyse, lokalisiert auf der dynamischen Schleifenregion zwischen den Aminosäuren 358-374 der C-terminalen Domäne, wurde erforscht. Enzymmutanten wurden entwickelt und erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Konformationsänderung des ALAS-Enzyms auf die Succinyl-CoA-Bindung zurückzuführen ist. Schließlich wurden Aminosäurereste ausgetauscht, die für die Interaktion mit der β-Untereinheit der Succinyl-Coenzym A Synthetase (βSCS) verantwortlich sind und stehen für Interaktionsstudien bereit. Zusammenfassend konnten entscheidende Schritte der ALAS-Katalyse durch eine Kombination aus kinetischen und strukturbiologischen Versuchen untersucht und auf molekularem Level aufgeklärt werden