Molekulare Klonierung von Benzophenonsynthase von Hypericum calycinum Zellkuturen und Versuche für die Transformation von Hypericum perforatum

Hypericum perforatum (St. John’s wort; Clusiaceae) is a medicinal plant used for the treatment of mild to moderate depression. Four classes of secondary metabolites (hyperforins, hypericins, xanthones and flavonoids) are involved in the antidepressant activity and exhibit different pharmacological properties. Polyketide synthases (PKSs) type III catalyse the formation of these active constituents using different starters, different number of added extender and different intermolecular cyclization mechanism. The transformation of H. perforatum may examine the biosynthetic pathway of the different secondary metabolites, especially hyperforin, which is the main active constituent of H. perforatum. An example used in the transformation is Agrobacterium-mediated transformation. A. tumefaciens can transfer benzophenone synthase (BPS) gene from related species (H. androsaemum) into H. perforatum. This can interact with the hyperforin formation pathway, producing a hyperforin derivative, which may exhibit similar pharmacological activities but fewer side effects than hyperforin. Benzophenone synthase catalyses the condensation of benzoyl-CoA with malonyl-CoA forming phlorbenzophenone, which is precursor of prenylated derivatives and xanthones. Xanthones are commonly minor constituents of H. perforatum. 1, 3, 6, 7-Tetrahydroxy-8-prenylxanthone was identified in yeast-treated cell cultures of related species; H. calycinum. A full-length cDNA encoding BPS with an ORF of 1200 bp was cloned from elicitor-treated cell cultures. The enzyme was functionally expressed and characterized. It shared 97.7% identity with BPS from H. androsaemum. It preferred benzoyl-CoA as starter substrate (km 10.83 μM). p- Coumaroyl and acetyl-CoAs were not accepted.Hypericum perforatum (Johanniskraut; Clusiaceae) ist eine Heilpflanze, die zur Behandlung von leichten bis mittelschweren Depressionen eingesetzt wird. Vier Klassen von sekundären Metaboliten (Hyperforine, Hypericine, Xanthone und Flavonoide) sind an der antidepressiven Wirkung beteiligt und weisen unterschiedliche pharmakologische Eigenschaften auf. Polyketidsynthasen (PKSs) vom Typ III katalysieren die Bildung dieser Wirkstoffe mit verschiedenen Startern, verschiedener Anzahl der Extender und verschiedenen intermolekularen Zyklisierungsmechanismen. Die Transformation von H. perforatum kann den Biosyntheseweg der verschiedenen sekundären Metabolite prüfen, insbesondere den des Hyperforins, das den wichtigsten aktiven Bestandteil von H. perforatum darstellt. Für die Transformation wurde u.a. die Agrobacterium-vermittelte Transformation angewendet. A. tumefaciens kann das Benzophenonsynthase (BPS)-Gen aus verwandten Arten (H. androsaemum) auf H. perforatum übertragen. Dies kann mit dem Biosyntheseweg von Hyperforin interagieren, wodurch ein Hyperforinderivat produziert werden kann, das ähnliche pharmakologische Aktivitäten, aber weniger Nebenwirkungen als Hyperforin zeigen könnte. Die Benzophenonsynthase katalysiert die Kondensation von Benzoyl-CoA mit Malonyl-CoA und anschließend die Bildung von Phlorbenzophenon, was die Vorstufe von prenylierten Derivaten und Xanthonen ist. Xanthone sind Nebenbestandteile in H. perforatum. 1, 3, 6, 7-Tetrahydroxy-8-prenylxanthon wurde in mit Hefe behandelten Zellkulturen von verwandten Arten, H. calycinum, identifiziert. Eine cDNA in voller Länge, die für die BPS kodiert, wurde mit einem ORF von 1200 bp aus Elicitor-behandelten Zellkulturen kloniert. Das Enzym wurde funktionell exprimiert und charakterisiert. Es wies 97,7% Identität mit der BPS aus H. androsaemum auf. Es bevorzugte Benzoyl-CoA als Startersubstrat (km 10,83 μM). p-Coumaroyl-CoA und Acetyl-CoA wurden nicht akzeptiert