Strukturelle und funktionelle Analyse der Levansucrase SacB aus Bacillus megaterium

Levansucrase SacB from B. megaterium synthesizes high molecular weight, beta-(2,6) linked levan from sucrose by transfer of fructosyl units. In this study, the structures of SacB variants Y247A, Y247W, N252A, D257A and K373A at resolutions between 1.75 and 2.0 Å have been determined. By means of SacB, it is shown for the first time that amino acids remote to the active site of a polysaccharide-forming enzyme have a well-defined and rationally explainable effect on the sugar polymer formation activity. The structural data is consistent with the kinetic and biochemical analyses. Conformational analyses of variants Y247A, Y247W, N252A and K373A reveal an unchanged active site architecture. Supporting the crystallographic data, the kinetic parameters of these variants are not significantly different compared to the wild-type SacB. Moreover, the structural data point towards a possible surface arrangement for the binding of an acceptor fructosyl chain. Residues Asn252, Lys373 and Tyr247 form a platform for a possible stabilization of the acceptor fructan chain. Defined subsites can be assigned to certain amino acids. Variants K373A, N252A and Y247A synthesize unique mixtures of oligosaccharides of clearly distinguishable and different chain lengths correlating to their subsites on the surface of SacB. These results lead to a better understanding of carbohydrate transfer mechanisms. However, structures of complexes between SacB and oligosaccharides of different length are still missing. They would provide a more comprehensive explanation of the transfructosylation process regarding oligo- and polysaccharide synthesis.Die Levansucrase SacB aus B. megaterium synthetisiert aus Saccharose hochmolekulares beta-(2,6) verknüpftes Levan durch die Übertragung von Fructosyl-Resten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kristallstrukturen der SacB Varianten Y247A, Y247W, N252A, D257A und K373A bei Auflösungen zwischen 1.75 und 2.0 Å bestimmt. Anhand von SacB konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Aminosäuren, die sich außerhalb des aktiven Zentrums befinden, einen definierten Einfluss auf die Synthese von Polysacchariden bei Glycosyltransferasen haben. Die ermittelten Daten der Strukturanalyse korrelieren zudem mit den Ergebnissen der kinetischen und biochemischen Untersuchungen. Die Architektur des aktiven Zentrums der verschiedenen Varianten ist unverändert und intakt. Diese Beobachtung wird durch die kinetischen Parameter der Varianten bestätigt, die nur leicht von den Werten des Wildtypenzyms abweichen. Darüber hinaus deuten die Kristallstrukturen auf ein mögliches Arrangement von Aminosäuren für die Bindung einer Akzeptor-Fructosylkette auf der Oberfläche des Enzyms hin. Die Aminosäuren Asn252, Lys373 und Tyr247 bilden eine mögliche Plattform für die Stabilisierung der wachsenden Fructosylkette. Eindeutige Bindungsstellen für die Zuckerkette konnten den ausgetauschten Aminosäuren zugeordnet werden. Die Varianten K373A, N252A und Y247A synthetisieren jeweils definierte Mischungen aus Oligosacchariden. Die klar unterscheidbaren Kettenlängen korrelieren mit den zugeordneten Bindungsstellen auf der Oberfläche des Enzyms. Diese Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis des Mechanismus zur Übertragung von Kohlenhydraten bei. Trotz dieses Beitrags mangelt es jedoch weiterhin an Komplexstrukturen aus Enzym und gebundenen Oligosacchariden, die eine noch präzisere Beschreibung dieser Prozesse erlauben würden