Entwicklung eines neuen Expressionssystemes für die Produktion rekombinanter Proteine in Chinese hamster ovary Zellen basierend auf der Selektion mit einem metabolischen Enzym

The Chinese hamster ovary (CHO) cell line is currently the most important mammalian production cell line for therapeutic proteins. The aim of this study was to use the proline auxotrophy of the CHO cell line as a selection system for the production of recombinant proteins. The gene of the enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS), one key enzyme of proline synthesis, was used as a selection marker. Using the CHO-S cells, selection times and expression levels comparable to those of antibiotic selection with neomycin or hygromycin B could be reached. Expressing the green fluorescent protein (GFP), three different monoclonal antibodies (anti-CD303, anti-CD14, anti-Biotin) in a two-vector strategy in combination with a zeocin selection or the cytokine hTGF-?1, stable cell lines with producer rates of over 90% were generated in less than 20 days. Stable cell lines with titers up to 8 mg/L (static, adherent, in minimal medium) and clones expressing up to 140 mg/L (limiting dilution, orbital shake reactor, suspension, fed-batch process) were generated for the production of anti-CD303. To further improve the proline selection system, a tricistronic vector allowing coexpression of fluorescent reporter proteins for the use of fluorescence as well as magnetic assisted cell sorting (FACS and MACS) was developed. Using a stable cell line expressing anti-CD303, FACS improved clone isolation when compared to a limiting dilution. MACS enrichment of stable cell lines revealed an 2.5- to 10-fold increase of titer. A combination of MACS enrichment of stable producer cell lines with clone isolation by FACS was proven to dramatically improve timelines and the manual amount of work. Clones producing up to 130 mg/L anti-CD303 antibody (orbital shake reactor, suspension, batch process) could be isolated by this combination. The developed P5CS expression systems offers a selection process without the need for any cytotoxic substances.Die Chinese hamster ovary (CHO Zelllinie) die am häufigsten verwendete Mammaliazelllinie zur Produktion therapeutischer Proteine. Das Ziel dieser Arbeit war die Prolin-Auxotrophie als Selektionssystem für die Produktion rekombinanter Proteine zu nutzen. Das Gen des Enzyms Pyrrolin-5-Carboxylat-Synthetase (P5CS), welches die Reaktion von Glutamat zu Pyrrolin-5-Carboxylat katalysiert, wurde als Selektionsmarker in einen dizistronischen Expressionsvektor kloniert. Mit der CHO-S-Zelllinie können sowohl Selektionszeiten als auch Expressionslevels vergleichbar zu Antibiotikaselektionssystemen mit Neomycin oder Hygromycin B erreicht werden. Stabile Zelllinien, die das grün-fluoreszierende Protein GFP, drei verschiedene Antikörper (anti-CD303, anti-CD14, anti-Biotin) oder das Zytokin hTGF-?1 exprimieren, konnten in weniger als 20 Tagen mit Produzentenraten von über 90% generiert werden. Für die anti-CD303-Produktion konnten so stabile Zelllinien mit Titern von 8 mg/L (statisch, adhärent, in Minimalmedium) und Klone mit Titern von bis zu 140 mg/L (limiting dilution, Schüttelinkubator, Suspension, fed-batch) isoliert werden. Um das neu etablierte Prolinselektionssystem weiter zu optimieren, wurde ein tricistronischer Expressionsvektor entwickelt, der die Koexpression von fluoreszierenden Reporter-proteinen erlaubt und sowohl für magnetische als auch durchflusszytometrische Zell-sortierung (MACS und FACS) genutzt werden kann. Im Vergleich zu einer traditionellen limiting dilution konnten mittels FACS Klone mit höheren durchschnittlichen Produktivitäten isoliert werden. Membrangebundene Fluoreszenzproteine können außerdem für eine schnelle Anreicherung mittels MACS genutzt werden. Eine Kombination aus einer MACS-Anreicherung von stabilen Zelllinien mit einer anschließenden Klonisolation mittels FACS ist geeignet sowohl Zeit- als auch Arbeitsaufwand zu reduzieren. Das entwickelte P5CS-Expressionssystem erlaubt eine Selektion ohne zytotoxische Substanzen