Investigation of the maturation of cytochrome cd1 nitrite reductase NirS from Pseudomonas aeruginosa PAO1

Die Cytochrom cd1 Nitritreduktase NirS aus P. aeruginosa ist ein gut charakterisiertes Protein. Trotz der bekannten Eigenschaften ist wenig über die Biosynthese und nichts über den Einbau des essenziellen Kofaktors Häm d1 in die NirS bekannt. Diese Arbeit diente dazu, neue Erkenntnisse über die Rolle der Proteine NirF und NirN zu gewinnen. Zunächst wurden NirF und NirN aus P. aeruginosa in silico analysiert. Nachdem festgestellt wurde, dass NirF eine Lipoprotein-Signalsequenz besitzt, wurde die Assoziation des Proteins an der inneren Membran von P. aeruginosa durch isopyknische Saccharose-Gradientenzentrifugation und Western-Blot-Analysen bewiesen In dieser Arbeit konnte erstmals eine Häm d1-freie NirS in E. coli produziert und gereinigt werden. Das hochreine Protein konnte zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern eingesetzt werden, die in Western-Blot-Analysen, Immunopräzipitationen und Immunoaffinitätsreinigungen zum Einsatz kamen. NirN konnte gereinigt werden und spezifische Antikörper gegen NirN erzeugt werden. Diese Antikörper wurden ebenfalls in verschiedenen Experimenten erfolgreich eingesetzt. In einer Reihe von Interaktionsexperimenten zwischen NirN und NirS konnte erstmals ein Komplex zwischen den Proteinen NirS und NirN nachgewiesen werden. Weiterhin zeigten diese Experimente und zusätzliche Pull-down-Analysen von NirF, dass dieses Protein ebenfalls an der Interaktion von NirN und NirS beteiligt ist und selbst mit diesen Proteinen interagiert. Abschließend wurde eine nirN-Deletionsmutante von P. aeruginosa daraufhin untersucht, ob NirN an der Häm d1-Biosynthese beteiligt sein kann. Dabei gab es erstmals Hinweise darauf, dass NirN am letzten Schritt der Häm d1-Biosynthese oder der Kofaktorinsertion in NirS beteiligt sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit trugen wesentlich zum besseren Verständnis der im Periplasma von P. aeruginosa ablaufenden Prozesse zur Nitritreduktase-Maturation bei. Zudem konnte ein neues NirS-Maturationsmodell postuliert werden.NirS, the cytochrome cd1 nitrite reductase of P. aeruginosa is a well characterized enzyme catalyzing the reduction of nitrite to nitric oxide. Despite its known structure and biochemical properties, less is known about the biogenesis of this protein. The biosynthesis and insertion of the heme d1-cofactor are poorly understood processes. The main objective of this work was to gain more insights into the roles of the proteins involved in the last step of heme d1-biosynthesis and cofactor-insertion into NirS. A first analysis of the protein NirF from P. aeruginosa in silico revealed a potential lipoprotein signal of NirF responsible for the attachment of the protein to the periplasmic face of the inner membrane. This was proven by isopycnic sucrose gradient centrifugation and western-blot-analysis. Furthermore, a heme d1-free version of NirS was produced in E. coli for the first time, purified and used for generation of antibodies, which were used in western-blot-analysis, immunoprecipitations and immuno affinitychromato-graphy. The protein NirN was purified and used for generating specific monoclonal and polyclonal antibodies. These antibodies were successfully used in several experiments. Interaction studies using co-immunoprecipitation and immunoaffinity chromatography revealed an interaction between NirS and NirN after in vivo protein-cross-linking. Furthermore, this interaction was dependent on the presence and interaction of NirF with the NirS-NirN-complex, which was shown in pull down-analysis and immunoaffinity chromatography. After analyzing the periplasmic fraction of a nirN-deletion strain of P. aeruginosa, new insights into the involvement of NirN in the heme d1-biosynthesis were gained. The results of this work led to a better understanding of the NirS maturation system and indicated the involvement of NirN and NirF in the last step of heme d1-biosynthesis and cofactor-insertion into NirS. All results are combined in a new model for the NirS maturation