Development and application of super-resolution fluorescence microscopy

Für eine drastische Erweiterung des Anwendungsfeldes der optischen Mikroskopie sorgte die in den letzten Jahren aufgekommene sogenannte Superauflösungsmikroskopie. Das klassische Modellsystem, um das Auflösungsvermögen derartiger Techniken zu vergleichen und zu quantifizieren, stellen Komponenten des eukaryontischen Zytoskeletts dar. Auch im Rahmen dieser Arbeit wurden derartige Zellstrukturen verwendet und anhand dessen ein quantitativer Wert für die Auflösung der Blink-Mikroskopie erhalten. Das System der Wahl waren dabei Aktinfilamente in vitro, in fixierten und in lebenden Zellen. Darüberhinaus wurde auch ein deutlich systematischerer Ansatz verfolgt, indem eine Matrix aus gezielt angeordneten Farbstoffmolekülen als Vergleichssystem verwendet wurde. Dabei wurde die gezielte Platzierung sowohl virtuell in Monte-Carlo-Simulationen, als auch real mithilfe eines Rasterkraftmikroskops durchgeführt. Die Platzierung von Farbstoffmolekülen durch die Verwendung von Rasterkraftmikroskopie wies allerdings einige Nachteile auf, wie etwa eine sehr aufwändige Durchführung und das Fehlen einer Möglichkeit zur Parallelisierung. Aus diesem Grund wurde im Folgenden auf die sogenannte DNA-Origami-Technik zurück gegriffen, um gezielte Farbstoffanordnungen zu generieren. Diese dienten nun als Testprobe sowohl für die Blink-Mikroskopie, als auch für die superauflösenden Techniken PAINT und SHRImP. Schließlich wurden DNA-Origamis als generelle Auflösungsstandards für die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie etabliert, wobei zur automatisierten Auswertung ein spezieller Algorithmus entwickelt wurde. Die Erweiterung auf den dreidimensionalen Fall gelang durch die Nutzung von Astigmatismus-basierter 3D-Lokalisierungsmikroskopie und die Verwendung einer speziell dafür designten dreidimensionalen DNA-Origami-Struktur. Die Möglichkeit einer unkomplizierten Auswertung wurde auch in diesem Fall durch die Entwicklung eines automatisierten Detektionsalgorithmus sichergestellt.In recent years the so called super-resolution microscopy yielded to a dramatic increase of applications in optical microscopy. The common used model system to compare and quantify the resolution values of those techniques is given by components of the eukaryotic cytoskeleton. Also within this work those cell structures were used for gaining a quantitative value of the resolution of Blink Microscopy. Thereby the systems of choice were actin filaments in vitro, in stained cells and in living cells. Furthermore a much more systematic approach was carried out by using a matrix of regular arranged dye molecules as a comparison system. Thereby the accurate placement was done virtually in Monte-Carlo-simulations as well as in reality by using an atomic force microscope. However, the arrangement of fluorescent molecules by using an atomic force microscope contains a number of disadvantages, e.g. the quite high effort of the process and the lack of possibilities for parallelization. For this reason in the following the so called DNA origami technique was used for generating specific arrangements of dye molecules. These structures now functioned as calibration probe for Blink Microscopy as well as for the super-resolution techniques PAINT and SHRImP. Finally DNA origamis were established as general resolution standards for localization based super-resolution microscopy. Thereby for automated data analysis a specific algorithm was developed. The expansion to the three-dimensional case succeeded by applying astigmatism-based 3D-localization-microscopy to a specific for this case designed three-dimensional DNA-origami-structure. The option for uncomplicated data analysis was also ensured by developing of an automatic detection algorithm