Hypericum perforatum subsp. angustifolium: Studie zur Xanthonbiosynthese in planta und in in vitro Systemen

The aim of the present research was to investigate xanthone biosynthesis in the plant and in in vitro systems of Hypericum perforatum subsp. angustifolium (Hpa), a rare subspecies rich in secondary metabolites. Xanthones are bioactive polyketides synthesized by benzophenone synthase (BPS). Phytochemical analysis showed that xanthones are mainly accumulated in the roots and that their presence is sensitive to environmental factors. Root from plantlets grown under controlled conditions and in vitro regenerated roots showed a stable and significatively higher xanthone content in comparison with the roots from wild grown plants. Extracts from in vitro roots showed antifungal activity against human fungal pathogens Candida spp., Cryptococcus neoformans and dermatophytes. The optimization of root culture conditions was achieved using the semi-synthetic carboxymethyl chitosan (CMC), as elicitor of xanthone biosynthesis. Through bioassayed-guided fractionaction, biyouxanthone D was isolated and found to be the main active principle against dermatophytes and C. neoformans. Since chitosan elicitation induced the expression of bps gene, a BPS transcript was cloned from elicited adventitious roots and expressed in E. coli and functionally characterized. Gene expression analyses through in situ hybridization experiments revealed that bps expression in roots is tissue-specific and localized in the first cortical parenchyma layer and more weakly in the endodermis. In conclusion the study revealed that xanthone biosynthesis and accumulation in Hpa occur in the roots. Moreover it has been showed that xanthones from Hpa are active against human pathogen fungi and that in vitro roots are a promising system for the production of extracts for applicative purposes in the formulation of therapeutic drugs.Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Xanthonbiosynthese innerhalb der Pflanze, sowie in in vitro Systemen von Hypericum perforatum subsp. angustifolium (Hpa), eine seltene Subspezies, die reich an Sekundärmetaboliten ist. Xanthone sind bioaktive Polyketide, die durch die Benzophenonsynthase (BPS) synthetisiert werden. Phytochemische Analysen konnten zeigen, dass Xanthon hauptsächlich in den Wurzeln der Pflanze akkumuliert werden und ihre Gegenwart abhängig von Umweltfaktoren ist. Pflanzenwurzeln, welche unter kontrollierten Bedingungen angezogen wurden und in vitro regenerierte Wurzeln zeigten einen stabilen und signifikant höheren Xanthonegehalt im Vergleich zu wild gewachsenen Pflanzen. Extrakten von in vitro-Wurzeln konnte antifungale Aktivität gegen die pilzlichen Humanpathogenen Candida spp., Cryptococcus neoformans und Dermatophyten nachgewiesen werden. Die Optimierung der Wurzelkultivierungsbedingungen konnte mit Hilfe des halbsynthetischen Carboxymethylchitosans (CMC) als Induktor der Xanthonbiosynthese erreicht werden. Durch bioassaygesteuerte Fraktionierung konnte Bioyouxanthon D isoliert und als die wichtigste aktive Komponente gegen Dermatophyten und C. neoformans identifiziert werden. Da Chitosan die Expression des Benzophenonsynthase-kodierenden Gens induzierte, wurde ein BPS-Transkript aus induzierten adventiven Wurzeln kloniert, in E. coli exprimiert und funktional charakterisiert. Genexpressionsanalysen durch in situ Hybridisierungsexperimente zeigten, dass die Expression von bps gewebespezifisch ist und im ersten kortikalen Parenchym lokalisiert ist, sowie auch schwächer in der Endodermis. Zusammenfassend deckte diese Studie auf, dass Xanthonbiosynthese und –anreicherung in Hpa in den Wurzeln stattfindet. Ausserdem wurde gezeigt, dass Xanthon aus Hpa aktiv gegen humanpathogene Pilze ist und dass in vitro-Wurzeln ein vielversprechendes System für die Produktion von Extrakten für Anwendungszwecke in der Formulierung therapeutischer Medikamente darstellt