Studies on the differences of the heme oxygenase isoenzymes and their relationship to NO-sensitive guanylyl cyclase

Die Arbeit befasst sich mit den Unterschieden der Hämoxygenase-Isoenzyme (HO-1 und HO-2) bezüglich der Stabilität der carboxy-terminalen Membrananker und der Interaktion mit der NADPH-abhängigen Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CPR). Die erhöhte Stabilität der HO-2 konnte auf einen höheren Oligomerisierungsgrad zurückgeführt werden. Dies könnte ursächlich für das unterschiedliche Translokationsverhalten in den Zellkern nach Inkubation unter Hypoxie sein. Ein Beleg hierfür ist, dass die Anwesenheit der CPR zu einer Stabilisierung der HO-1 führte und die Translokation der HO-1 unter Hypoxie ausblieb. Weiterhin wurden die HO-2-spezifischen Hämbindemotive (CPF-Motive) untersucht, die allerdings keinen Einfluss auf die Stabilität, die Enzymaktivität und auf das Ausbleiben der nukleären Translokation der HO-2 haben. In der a1-Untereinheit der Stickstoffmonoxid-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NOsGC) konnte ebenfalls ein CPF-Motiv identifiziert werden. Untersuchungen von Wildtyp und einer CPF-Mutante zeigten keine Unterschiede bei der Enzymaktivität und des Redoxstatus in der Zelle. Weiterführende Experimente könnten zur Aufklärung der Rolle des amino-terminalen Bereichs der a1-Untereinheit und des CPF-Motivs bei der NOsGC-Aktivierung beitragen. Koexpressionsversuche von HO und NOsGC im eukaryotischen Expressionssystem zeigten, dass die Anwesenheit von HO-1 und HO-2 die Aktivierung der NOsGC durch NO reduziert. Untersuchungen mit dem NOsGC-Aktivator Cinaciguat in An- und Abwesenheit des NOsGC-Inhibitors ODQ lassen darauf schließen, dass die HO-Koexpression zu einer verminderten Hämhaltigkeit der NOsGC führt, woraus auch der verringerte NOsGC-Gehalt resultieren kann. Die Koexpression der humanen Biliverdinreduktase schien durch die vermehrte Bildung des antioxidativen Bilirubins einen protektiven Einfluss auf die Hämgruppe zu besitzen. Die Ergebnisse zeigen, dass im rekombinanten Expressionssystem die HO-Formen und das hämabbauende System die NOsGC beeinflussen.This study deals with the differences between the heme oxygenase isoenzymes (HO-1 and HO-2) and focuses upon their different stability with respect to the carboxy-terminal membrane anchor and the interaction with the NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase (CPR). The increased stability of HO-2 is most likely attributed to a higher degree of oligomerization. It is suggested that this was the reason for different nuclear translocation of HO-1 and HO-2 under hypoxic conditions. Further evidence for this is that the presence of CPR led to a stabilization of HO-1 that did not translocate. Another focus was the investigation of the heme-binding motifs (CPF-motifs) of HO-2, which are specific for this isoenzyme. The CPF-motifs have no influence on the stability, enzyme activity and nuclear translocation of HO-2. Through amino acid sequence analysis, a CPF-motif could also be identified in the a1-subunit of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase (NOsGC). Studies showed no differences between the wild type and an enzyme carrying a CPF-mutation, with respect to the enzyme activity and the redox status of the cell. Further experiments should be performed, since the role of a1-subunit´s amino-terminal region in activation of NOsGC was not sufficiently clarified. At the end HO and NOsGC were co-expressed in a eukaryotic expression system. It could be demonstrated that the presence of HO isoenzymes reduces NOsGC activation by NO. Studies, with NOsGC activator cinaciguat in the presence or absence of NOsGC inhibitor ODQ, suggest the co-expression of HO isoenzymes leads to a reduced heme content in NOsGC. The reduced NOsGC expression in the presence of HO is probably also a result of reduced heme levels. However, the co-expression of human biliverdin reductase (hBVR) showed a protective effect on the heme group through increased formation of the antioxidant bilirubin. The results show that in a recombinant expression system, HO forms and the heme degrading system influence NOsGC