Die gegenseitige Beeinflussung synthetischer Expressionskassetten in definierten chromosomalen Abschnitten

Heterogeneity in transgene expression is frequently observed upon genetic modification of cells in basic research and biotechnology. The variable transgene expression is considered to be a result of the crosstalk of the incoming promoter cassette with cis-acting elements associated with the chromosomal site of transgene integration (position effect). Targeted integration of the transgene into the open chromatin reduces variability due to chromosomal position effects and also favors the more predictable transgene expression. The objective of this study was to have a mechanistic understanding of the nature of interaction that occurs between the transgenic/synthetic cassettes when integrated into defined chromosomal sites. To this end CMV driven transgene expression were investigated in more than 100 independent cell clones in two different cell lines (CHO and HEK293T). Not only was the transgene expression highly variable among clones but also large levels of heterogeneity in expression existed within clones with metastable phenotype. This was correlated with differential and dynamic chromatin conformation related to differential histone modifications. In addition, a CMV based Tetracycline inducible synthetic promoter (BiTet) was evaluated in the well-characterized Rosa26 locus.The epigenetic status of the promoter cassette was evaluated in mouse ES cells and transgenic mice to investigate the mechanisms mediating the interaction between the transgene and the chromosomal loci that results in variation of transgene expression. Contrary to the expectation, even upon targeting the ubiquitous Rosa26 locus, the expression of the synthetic cassette driven by tetracycline inducible synthetic promoters (BiTet) was highly heterogeneous. However in this analysis the endogenous Rosa26 locus largely remained methylation free. While DNA methylation was the major player in the silencing of the Tetracycline based promoter systems in the Rosa26 site, the heterogeneity associated with the hCMV driven constructs in random CHO and HEK293T clones was entirely associated with distinct histone modifications causing variable transgene expression and transgene silencing. While the heterogeneous expression was found to be associated with different chromatin states conferred by various epigenetic markings, the stability and extent of the variation in transgene expression may largely depend on the nature of crosstalk between the chromosomal integration site and the synthetic construct.Genetisch manipulierte Zellen werden oft in der Biotechnologie und der Grundlagenforschung verwendet. In diesen genetisch manipulierten Zellen kommt es oft zu unerwünschten heterogenen Transgen-Expressionen, die oft ein Nebeneffekt von sogenannten Positionseffekten sind. Diese Positionseffekte entstehen durch die Interaktion der Promoter-Kassetten mit den im Genom codierten Cis agierenden Elementen, was zu unterschiedlichen Transgenexpressionen führt. Die gezielte Integration eines Transgens in einen offenen Chromatin-Abschnitt reduziert den sogenannten Positionseffekt und führt zu einer vorhersagbareren Expression.Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von transgenen/synthetischen Kassetten an verschiedenen chromosomalen Integrations-Orten um die sogenannten Positionseffekte und den chromosomalen "crosstalk" genauer zu charakterisieren. Von zwei verschiedenen Zelllinien (CHO und Hek293T) wurden 100 Klone analysiert. Diese Klone wurden auf die Expression der integrierten Transgen-Kassette überprüft. Hierbei wurde das Transgen von einem CMV Promoter exprimiert. Zum Einen zeigte die Analyse der Zellen, dass die einzelnen Klone mit der gleichen Transgenkassette an verschiedenen Integrationsorten unterschiedliche Expressionsmuster aufwiesen (interklonale Expressionsunterschiede). Interressanterweise änderten sich zum Anderen diese Expressionsmuster der analysierten Klone nach mehrmaligen passagieren (Intraklonale Expressionsunterschiede). Das heisst, dass Zellen mit der gleichen Transgenkassette an dem gleichen Integrationsort ihr Expressionsmuster verändern. Diese intraklonalen Unterschiede wurden als metastabil bezeichnet. Die unterschiedlich exprimierenden Zellen in den metastabilen Klonen wurden genauer charakterisiert. Hierbei korrelierten die verschiedenen Expressionsmuster mit den unterschiedlichen Histon Modifikationen und somit mit den chromatin Konformationen. Zusätzlich wurde ein CMV basierter synthetischer Promoter, Tetracycline abhängiger Promoter (BiTet), in einem gut charakterisierten Lokus, dem R26 Lokus, analysiert. Obwohl der Promoter (BiTet) in diesem ubiquitär aktiven Lokus integriert wurde, zeigte die Expressionsanalyse, sowohl in Maus-Stammzellen als auch in transgenen Mäusen, überraschenderweise eine heterogene Expression. Anhand der epigenetischen Analysen konnte gezeigt werden, dass der Bitet Promoter methyliert wird, wobei der endogene R26 Promoter hauptsächlich frei von Methylierungen bleibt. Während das Silencing der Bitet Kassette in dem R26 Lokus und somit die heterogene Transgenexpression hauptsächlich auf die Methylierung der DNA zurückzuführen ist, ist das Silencing der analysierten CHO und HEK293T Klone, die zufällig im Genom integrierten, ein Resultat der Histon Modifikationen. Nichts desto trotz, während die Heterogenität der Transgenexpression von verschiedenen Chromatin-Zuständen, die über bestimmte epigenetische Markierungnen etabliert werden, abhängt, ist die Stabilität und die Stärke der heterogenen Expression abhängig von der Interaktion des synthetischen integrierten Konstrukts und des chromosomalen Integrations-Ortes