Eigenschaften und chemische Eigenschaften von Escherichia coli Curli

Curli are the major proteinaceous component of a complex extracellular matrix produced by many enterobacteriaceae. They are involved in adhesion to surfaces, cell aggregation, and biofilm formation. They are also potent inducers of the host inflammatory response. Curli are amyloid fibers 6-12 nm in diameter and several ?m in length. CsgA is the major subunit of Curli, while CsgB is the minor nucleator subunit. The N-terminus of CsgB is involved in the nucleation of CsgA while the C-terminus is important for self-folding of CsgB. High-resolution structural information of Curli fibers will be a prerequisite to gain insights into its assembly and functions, and might help to understand the differences between disease-related and functional amyloids. In this work, I aimed to compare to the structural properties of natively produces Curli with those of in-vitro generated fibrils composed of CsgA and/or CsgB. The bacterial amyloid Curli offers therefore the unique opportunity to compare the structural properties of recombinant and natively produce amyloid fibrils. I developed the protocol to express and purify sufficient amount of uniformly 15N,13C-labelled native Curli from the Escherichia coli MC4100 strain for solid-state NMR analysis. A 2D 13C-13C solid-state NMR spectrum of native Curli revealed a striking similarity to the spectra obtained from recombinant CsgA fibrils, implying that CsgA fibrils adopt a highly similar tertiary structure compared to native Curli. CsgB can nucleate CsgA to form mixed CsgA-CsgB fibrils with any mixing ratio. The mixed fibrils revealed a highly ordered, amyloid-like conformation similar to native Curli. I investigated in-vitro fibrilized mixed fibrils using immunogold labelling TEM, controlled fragmentation by shear-force combined with seeding assays and H/D exchange NMR. Immungold labelling TEM images of mixed fibrils clearly displayed that CsgB is located not only at the ends but also in between CsgA molecules in mixed fibrils. Both the N-terminal region and C-terminal region of CsgB could interact with neighbouring CsgA molecules respectively. Mixed CsgA-CsgB fibrils appeared to be fragmented into optimal seeds at slightly lower shear forces compared to pure CsgA fibrils, possibly indicating that interspersed CsgB weakens the overall stability of CsgA fibrils. H/D exchange data showed that interspersed CsgB formed a more ordered ß-sheet structure in mixed fibrils.Curli ist der Hauptproteinbestandteil einer komplexen, extrazellulären Matrix, die von vielen Enterobacteriaceae gebildet wird. Es ist an der Oberflächenadhäsion, an Zellaggregation und an der Biofilmbildung beteiligt. Darüber hinaus ist es ein effizienter Auslöser von Entzündungsreaktionen im Wirt. Bei Curli handelt es sich um Amyloidfibrillen mit einem Durchmesser von sechs bis zwölf Nanometern und einer Länge von mehreren Mikrometern. Die Hauptuntereinheit von Curli ist CsgA, während die Nebenkomponente CsgB als Nukleator fungiert. Dabei ist der N-Terminus von CsgB für die Nukleation von CsgA verantwortlich, während sein C-Terminus eine Rolle bei der Selbstfaltung von CsgB spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Unterschied struktureller Eigenschaften von nativ produziertem Curli und in vitro hergestellten Fibrillen von CsgA und/oder CsgB untersucht. Das bakterielle Amyloid Curli bietet hiermit die seltene Gelegenheit, die strukturellen Eigenschaften von rekombinant und natürlich hergestellten Amyloidfibrillen zu untersuchen. Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, um ausreichende Mengen an 15N,13C-markiertem, nativen Curli aus Escherichia coli MC4100 für die Analyse mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie zu exprimieren und zu reinigen. Ein 2D 13C-13C-Festkörper-NMR-Spektrum von nativem Curli zeigte starke Ähnlichkeit zu solchen Spektren, die von rekombinanten CsgA-Fibrillen aufgenommen wurden. Dieser Befund impliziert, dass die Tertiärstruktur von CsgA-Fibrillen große Ähnlichkeit mit der von nativem Curli besitzt. In vitro hergestellte, gemischte Fibrillen wurden mittels Immungold-TEM, kontrollierter Fragmentierung durch Scherkraft in Kombination mit Nukleationsversuchen und H/D-Austausch-NMR-Spektroskopie untersucht. Immungold-TEM-Aufnahmen konnten dabei eindeutig belegen, dass CsgB nicht nur an den Enden, sondern auch zwischen den einzelnen CsgA-Molekülen der gemischten Fibrillen vorkommt. Sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Regionen von CsgB interagieren dabei mit benachbarten CsgA-Molekülen. Die Fragmentierung von gemischten CsgA-CsgB-Fibrillen erforderte im Vergleich mit reinen CsgA-Fibrillen anscheinend leicht geringere Scherkräfte. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die eingestreuten CsgB-Einheiten die Gesamtstabilität der Fibrillen verringern. H/D-Austauschdaten haben gezeigt, dass eingestreuten CsgB bildeten eine geordnetere ß-Faltblattstruktur im gemischten Fibrillen