Characterization of the Legionella pneumophila virulence factor PilY1

Legionella pneumophila ist, als fakultativ intrazelluläres Bakterium, der Erreger der Legionärskrankheit, einer atypischen Lungenentzündung. Von zentraler Bedeutung für die Pathogenität von L. pneumophila ist die Eigenschaft die endolysosomale Degradation der Wirtszelle zu inhibieren. In vorangegangenen Arbeiten konnten L. pneumophila Transposonmutanten mit Defekten in der Inhibition der phagolysomalen Fusion identifiziert werden. Eine Mutante wies Insertionen in dem Gen pilY1 auf und zeigte eine signifikant erhöhte lysosomlae Kolokalisation. Das L. pneumophila PilY1, insbesondere der C-Terminus, weist starke Homologien zu dem PilY1 von Pseudomonas aeruginosa sowie zu den PilC Proteinen von pathogenen Neisseria spp. auf. Diese Proteine beeinflussen die Typ IV Pilus Biogenese und Stabilität. Außerdem konnte am N-Terminus eine von Willebrand Faktor A (vWFa) Domäne identifiziert werden. vWFa Domänen sind unter anderem bei extrazellulären eukaryotischen Proteinen an der Zell-Zell Interaktion beteiligt. Bei P. aeruginosa wird zudem eine Funktion der vWFa Domäne als ein Mechanosensor diskutiert. Da PilY1 an Regulation der Oberflächen-induzierten Virulenz beteiligt ist. Durch zelluläre Fraktionierung und Expressionsstudien konnte gezeigt werden, dass PilY1 an der äußeren Membran von L. pneumophila lokalisiert ist und in der transmissiven Wachstumsphase exprimiert wird. Diese Phase zeichnet sich durch die vermehrte Expression von Virulenzfaktoren aus, um eine erneute Wirtszellinfektion zu gewährleisten. Infektionsexperimente mit humanem, explantierten Lungengewebe (HLTEs), THP-1 Makrophagen sowie A549 Epithelzellen zeigten die Beteiligung von PilY1 und der Adhäsion und Invasion sowie der intrazellulären Replikation von L. pneumophila. Darüber hinaus PilY1 trägt zu der bakteriellen Oberflächentranslokation Twitching und Sliding Motility bei. Dies könnte auf eine Beteiligung von PilY1 an der Migration von L. pneumophila innerhalb des infizierten Lungengewebes hindeuten. Funktionelle Komplementationsexperimente mit verkürzten PilY1 Varianten demonstrierten, dass die C-terminale PilY Domäne die vorliegenden Oberflächenphänotypen vermittelt. Hingegen bleibt die regulatorische Funktion der vWFa Domäne hypothetisch. Konsistent mit P. aeruginosa und pathogenen Neisseria spp. konnte für L. pneumophila eine putative Ca2+ Bindungsdomäne identifiziert werden. Eine signifikante Ca2+ Bindung der C-terminale PilY-Domäne messbar und bedarf weiterer Untersuchungen. Zusammenfassend konnte PilY1 als neuer Adhäsionsfaktor identifiziert werden, welcher nicht nur für die bakterielle Internalisierung sondern auch an der erfolgreichen Etablierung der LCV beteiligt ist.Legionella pneumophila is a facultative intracellular bacterium which causes a severe form of pneumonia - Legionnaires’ disease. A key feature of L. pneumophila pathogenicity is the ability to reprogram the degradative intracellular trafficking. In previous work L. pneumophila transposon mutants that are attenuated in escaping the lysosomal degradation have been selected. One of the mutants shows a significantly higher co-localization with the lysosomal compartment and exhibits transposon insertions in the pilY1 gene. The L. pneumophila PilY1 protein, which shares high homology to the virulence factor PilY1 of Pseudomonas aeruginosa and PilC of Neisseria spp, represents a comparable domain composition. It possesses an N-terminal von Willebrand factor A (vWFa) domain and a PilY1 domain at the C-terminus. The vWFa domain is involved in cell adhesion and is originally found in extracellular eukaryotic proteins whereas the PilY1 domain is proposed to influence type IV pilus biogenesis and stability. Beyond that, in P. aeruginosa the vWFa domain is discussed to function as a mechanosensor in order induce surface dependent virulence. By cellular fractionation and Western blotting experiments the L. pneumophila PilY1 could be assigned as outer membrane protein that is only expressed during the transmissive stationary growth phase. This growth phase is characterized by enhanced virulence factor expression in order to promote transmission to new host cells. Infection assays with human lung tissue explants (HLTEs), THP-1 macrophages and A549 epithelial cells demonstrated that PilY1 not only contributes to the intracellular survival and replication but specifically to adhesion to and invasion of host cells. Since PilY1 also promotes bacterial surface motility of L. pneumophila, like twitching motility and sliding motility, a putative contribution of this virulence factor on bacterial dissemination within infected lung tissue could be possible. Re-complementation variants of PilY1-negative mutants revealed that the C-terminal PilY domain was essential to restore these multiple surface behaviors, while a mechanosensitive regulatory function of the vWFa domain remains hypothetical. Consistent to the findings in Pseudomonas and Neisseria a potential L. pneumophila PilY1 Ca2+ binding motive could be identified. But a significant Ca2+ interaction of the PilY1 domain as well as its possible regulatory function in type IV pilus biogenesis could not be demonstrated and needs further investigation. In summary, it can be proposed that PilY1 functions as adhesion factor, which not only influences the bacterial uptake by host cells, but also the successful establishment of the early LCV by providing close cell-cell contact for effective effector translocation