Generation of switchable antibody fragments

ScFv-Antikörperfragmente werden in einer Vielzahl von Anwendungen genutzt, wie in der Forschung, Diagnostik und sogar für therapeutische Zwecke. Für die meisten Anwendungen ist dabei die außergewöhnliche Spezifität, Selektivität und Affinität der Antikörper essentiell. Allerdings sind hierbei bedingt durch die oft sehr hohen Affinitäten der Antikörper harsche Elutionsbedingungen notwendig, welche typischerweise die Faltung, Integrität und Viabilität des eluierten Materials beeinträchtigen. Antikörper mit hoher Spezifität und zugleich modulierbarer Affinität wären somit von großem Vorteil. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Konformationsänderungen in der Linkerregion zwischen VH und VL eines scFv-Fragments die Konformation der Antigenbindestelle beeinflussen können, woraus eine Modulation der Affinität resultiert. In dieser Arbeit wurden alle möglichen Orientierungen eines zirkulär permutierten Calmodulin (CaM)-Moleküls als Linkerregion in den Lysozym-bindenden scFv D1.3 inseriert. Unter Einfluss von Calcium und CaM-Bindepartnern erfährt CaM starke Konformationsänderungen. Vorinkubation mit dem konformationsändernden M13-Peptid, unter Einfluss von Calcium, führte zu signifikanten Änderungen in der Antigenbindung zahlreicher scFv-CaM-Fusionen. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine Dissoziation des bereits etablierten Antikörper-Antigen-Komplexes durch Zugabe von M13-Peptid und Calcium möglich ist. Im Anschluss erfolgte die Klonierung der vielversprechendsten CaM-Linkervarianten in weitere scFv-Spezifitäten, da evaluiert werden sollte, ob eine Übertragung der Linkermodule auf andere Spezifitäten ebenfalls in schaltbaren Antikörperfragmenten resultiert. In insgesamt 5 von 6 getesteten Spezifitäten mit sehr unterschiedlichen Affinitäten und Antigenen bewirkten ausgewählte Linkervarianten eine peptidabhängige Modulation der Affinität. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auch andere CaM-Bindepeptide alternativ zum M13-Peptid eingesetzt werden können. Ferner konnte in manchen Fällen auch eine Umkehrung des Schaltverhaltens beobachtet werden. Zudem konnte exemplarisch an einer scFv-CaM-Variante gezeigt werden, dass die M13-Peptid-abhängige Abnahme der Affinität sehr wahrscheinlich auf einer Änderung der Paratopstruktur des scFvs beruht. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass im Rahmen dieser Arbeit ein universelles linkerbasiertes System zur Modulation von Antikörper-Antigen-Bindungsaffinitäten in scFv-Fragmenten generiert werden konnte.ScFv-antibody fragments are used in a variety of applications, such as for research, diagnostic purposes and even as therapeutics. Essential for most applications is the extraordinary specificity, selectivity and affinity of the antibodies. However, the usually very high affinity of antibodies requires harsh elution conditions for the proteins to be purified, which typically impairs folding, integrity or viability of the eluted materials. Therefore, antibodies which retain their specificity while being adjustable in respect of their affinity would be advantageous. Conformational changes in the linker between the VH and VL of an scFv can affect the conformation of the antigen binding site itself, resulting in a modulation of affinity. In this work, all possible orientations of a circularised calmodulin (CaM) molecule were inserted as a linker in lysozyme binding scFv (D1.3). CaM undergoes large conformational changes depending on the presence of calcium and CaM-binding peptides. Preincubation with the conformation-modulating M13 peptide, in the presence of calcium, led to significant changes in antigen binding. More importantly, antibodies could be released from their antigen by adding M13 peptide and calcium. The most promising CaM-linker variants were applied to other scFv of different specificity. For 5 out of 6 tested scFv fragments, the identified linkers resulted in a significant “affinity-switch”, suggesting that this approach may be applicable to many other scFv fragments for modulation of antibody affinity. Moreover, additional CaM-binding peptides were analysed with regard to affinity modulating properties. Most of the tested peptides resulted in a change in binding signal in at least one of the analysed scFv-CaM-fusion proteins. Thus, an inverse switching behaviour in comparison to the signal change induced by M13 was observed for certain peptide candidates. Further testing was done to assure that “switching” is due to a change in paratope structure of the scFvs, rather than to dimerisation and aggregation. The results obtained exemplary for one scFv-CaM-variant, showing a distinct decrease of binding signal in response to peptide M13, indicated that a loss in binding affinity is based on a change in paratope structure. In summary, a universal linker-based system to modulate antibody-antigen binding affinities in scFv-fragments was established in this work