Transkriptionelles, proteomisches und metabolisches Netzwerk des Fur regulierten Eisenmetabolismus von Clostridium difficile

Clostridium difficile is known as a human pathogen causing diarrhea among patients in hospitals and health care units worldwide. C. difficile is a Gram-positive, strict anaerobic, spore-forming and toxin producing bacterium. In order to stop the growth of infectious microorganisms during infection the host restricts the excess to iron for the pathogens by producing iron- and siderophore-chelating proteins, by exporting iron from intracellular pathogen-containing compartments, and by limiting absorption of dietary iron. Consequently, infectious bacteria have to adjust their iron uptake and utilization strategies. Almost nothing was known about the regulation of iron uptake by C. difficile in the mammalian gut of the beginning of this thesis. Consequently, different possible iron sources were tested. A genomic knock out of the gene for the ferric uptake regulator Fur was generated using the ClosTron system. Fur displayed a clear growth deficiency compared to C. difficile wild type cells. Morphological experiments showed reduced flagella and pili formation in the fur mutant strain. Surprisingly, the toxin production was not affected by Fur. Subsequently, the wild type and fur mutant strain were subjected to a systems biology investigation using transcriptome, proteome and metabolome analyses to define the iron- and Fur regulon in C. difficile. Several iron-associated transporters as well as major energy metabolic pathways (e.g. L-leucine fermentation, proline metabolism, butyrate fermentation) are controlled in an iron dependent Fur regulated manner. Furthermore, flagella formation is positively regulated by iron and Fur. A consensus Fur-binding sequence was defined and potential Fur-boxes upstream of for example flagella associated genes and a ferrichrome transporter operon were found. Taken together, the regulator Fur is not only involved in the regulation of iron associated genes but also in processes of the central metabolism in C. difficile.Clostridium difficile ist ein humanpathogenes Bakterium, welches Durchfälle in Krankenhäusern weltweit verursacht. C. difficile ist ein Gram-positives, strikt anaerobes, sporenbildendes und Toxin bildendes Bakterium. Um das Wachstum von infektiösen Mikroorganismen während einer Infektion zu stoppen, bildet der Wirtsorganismus Eisen chelatierende Proteine. Folglich müssen Bakterien die Eisenaufnahme und Verwertung an die jeweiligen Bedingungen im Wirt anpassen und regulieren können. Zu Beginn dieser Arbeit war sehr wenig über das genregulatorische Netzwerk der Eisenaufnahme in C. difficile bekannt. Daher wurden verschiedene mögliche Eisenquellen getestet. Eine genomische Mutante des „ferric uptake regulators“ Fur wurde mittels des ClosTron Systems generiert. Die fur Mutante zeigte einen klaren Wachstumsdefizit gegenüber des Wildtyp Stammes. Morphologische Experimente zeigten, dass die fur Mutante im Vergleich zum Wildtyp weniger Flagellen und Pili produzierte. Interessanterweise konnte kein Zusammenhang zwischen der fur Mutation und der Toxinproduktion festgestellt werden. Im Anschluss wurde die fur Mutante in einem systembiologischen Versuch mittels Transkriptom, Proteom und Metabolom Analysen untersucht, um das Eisen- und Fur-Regulon in C. difficile zu definieren. Mehrere Eisenassozierte Transporter sowie Prozesse des zentralen Energiestoffwechsels (z.B. Leucin-Fermentation, Prolin-Fermentation und Butyrat/Butanol- Fermentation) werden in einer eisenabhängigen Fur-regulierten Weise gesteuert. Darüber hinaus wird die Flagellen Formation durch Eisen und die Fur Mutation positiv reguliert. Eine Konsensussequenz, die sogenannte Fur-Box, wurde definiert und potentielle Fur-Boxen konnten upstream von Flagellenassoziierten Genen sowie einem Ferrichrom-Operon gefunden werden. Zusammenfassend ist der Regulator Fur nicht nur an der Regulation von Eisentransportern, sondern auch an Prozessen des zentralen Stoffwechsels beteiligt