The last step of nitrite reductase cofactor Heme d1 biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa

In dieser Arbeit wurde der letzte Schritt der Biosynthese des Nitritreduktase Kofaktors Häm d1 in P. aeruginosa untersucht. Der biosynthetische Vorläufer von Häm d1, Dihydrohäm d1, wurde zum ersten Mal aus der nativ gereinigten Nitritreduktase NirS aus dem P. aeruginosa Stamm RM361 (nirN::tet) isoliert und charakterisiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das periplasmatische Protein NirN die Umsetzung von Dihydrohäm d1 zu Häm d1 katalysiert, wohingegen NirF sowohl Dihydrohäm d1 als auch Häm d1 bindet, diese aber nicht weiter umsetzt. Für die Isolierung von Dihydrohäm d1 wurde zunächst ein geeignetes Produktions- und Reinigungsprotokoll für die native Nitritreduktase NirS aus dem P. aeruginosa Stamm RM361 etabliert. Das proteingebundene Dihydrohäm d1 wurde mittels UV/Vis- und Resonanz-Raman Spektroskopie genauer untersucht. Zusätzlich wurde Dihydrohäm d1 aus der gereinigten NirS extrahiert und mittels UV-Vis Spektroskopie, HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert. Dabei wurde der Kofaktor zweifelsfrei als Dihydrohäm d1 identifiziert. Um zu zeigen, dass NirN den letzten Schritt der Häm d1 Biosynthese katalysiert, wurde ein Enzymaktivitätsassay mit Dihydrohäm d1 als Substrat etabliert. NirN war dabei in der Lage, Dihydrohäm d1 zu Häm d1 umzusetzen. Die Durchführung des Aktivitätsassays unter anaeroben Bedingungen zeigte, dass der NirN gebundene Häm c Kofaktor während der Katalyse reduziert wird. Eine NirN Variante, die keine N-terminale Domäne und somit keinen Häm c Kofaktor enthielt, war komplett inaktiv. Mit Hilfe von Zyklovoltammetrie wurden die Redoxpotentiale des NirN gebundenen Häm c Kofaktors, sowie die von Häm d1 und Dihydrohäm d1 bestimmt. Das Produktions- und Reinigungsprotokoll für NirF aus D. shibae wurde optimiert. Es wurde außerdem mittels UV-Vis Spektroskopie gezeigt, dass NirF in der Lage ist, Häm d1 und Dihydrohäm d1 zu binden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen jedoch, dass NirF nicht in der Lage ist, Dihydrohäm d1 umzusetzen. Durch Kristallisations-experimente konnten Kristalle von NirN und NirF erzeugt werden. Jedoch war es nicht möglich, Datensätze von den Kristallen aufzunehmen. Anhand der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse konnte das Maturationsmodell der Nitritreduktase NirS in P. aeruginosa verfeinert werden.Heme d1 is the unique cofactor of the nitrite reductase which catalyzes the second step of denitrification. This work aimed to elucidate the last enzymatic step in heme d1 biosynthesis. The biosynthetic heme d1 precursor, dihydroheme d1 was isolated for the first time from the P. aeruginosa mutant RM361 (nirN::tet). It was shown that the periplasmatic potein NirN catalyzes the conversion of dihydroheme d1 to heme d1. NirF binds heme d1 as well as dihydroheme d1 but does not convert the latter to heme d1. The nitrite reductase NirS was isolated from the P. aeruginosa strain RM361 using a novel protocol. The NirS bound dihydroheme d1 was characterized using UV-Vis spectroscopy as well as Resonance Raman Spectroscopy. Dihydroheme d1 was extracted from NirS and characterized using UV-Vis spectroscopy, HPLC and masspectrometry. Using these methods, the NirS cofactor from the P. aeruginosa mutant RM361 could be identified as the heme d1 precursor dihydroheme d1. NirN was shown to generate heme d1 in an enzymatic activity assay using dihydroheme d1 as a substrate. By perfoming the activity assay under anaerobic conditions, it was shown that the NirN bound heme c cofactor is reduced during the conversion of dihydroheme d1 to heme d1. A NirN variant lacking the heme c binding domain was completely inactive. Using protein film voltammetry, the reduction potential of the NirN bound heme c cofactor could be determined. The results suggest that NirN is an electron bifurcating dehydrogenase that forms its product in the reduced state and transfers the other electron from the reaction to its bound heme c cofactor. Moreover, the production and purification of NirF from D. shibae was improved. NirF was shown to bind heme d1 and dihydroheme d1. However, NirF was not able to convert dihydroheme d1 to heme d1. Crystals of NirN and NirF could be obtained, yet the crystal structure of both proteins could not be solved. The model for nitrite reductase maturation could be refined using the insights gained from this work