Biochemische und molekulare Untersuchungen des Benzoesäure-Stoffwechsels in Hypericum calycinum-Zellkulturen

Xanthones are polyketide scaffolds with astounding pharmacological potency. Elicitor-treated cell cultures of Hypericum calycinum (Hc) accumulate prenylated xanthones. Benzoyl-CoA is required for the catalysis of the first committed step of their biosynthesis. In Hypericum, the formation of benzoyl-CoA proceeds by the CoA-dependent non-ß-oxidative route. This route was biochemically established but only a peroxisomal cinnamate-CoA ligase (CNL) was defined at the molecular level. Molecular information of the other genes in the pathway remained elusive. The aim of the current work was cDNA cloning, functional characterization and subcellular localization of benzaldehyde dehydrogenase (BD) and benzoate-CoA ligase (BZL) from xanthone-accumulating yeast extract-treated Hc cells. BD catalyzes the conversion of benzaldehyde to benzoic acid, which is metabolized to benzoyl-CoA by BZL. Based on publicly available transcriptomic resources and homology-based cloning strategies, the first plant full-length HcBZL cDNA was isolated. The 1647 bp coding sequence encoded a ~60 kDa soluble protein with pI 6.6. The HcBD cDNA had a 1506 bp coding sequence and it encoded a soluble protein with 54.2 kDa subunit mass and pI 6.01. Substrate screening with 10 potential substrates revealed that HcBD primarily catalyzed the conversion of trans-cinnamaldehyde and benzaldehyde to their corresponding acids. Out of 24 potential substrates offered to HcBZL in a luciferase-based substrate specificity assay, benzoic acid was the only aromatic acid to be activated. Additionally, short-chain fatty acids (C3-C7) were converted to their CoA thioesters. Expression analyses indicated the upregulation of both HcBD and HcBZL after yeast extract treatment of cultured cells, which preceded xanthone accumulation. The maximum xanthone content was 4.7 mg/g dry weight. The results suggested the in vivo participation of the two genes in the CoA-dependent non-ß-oxidative route, which directs carbon flux from the benzenoid biosynthetic pathway towards the xanthone biosynthetic route. Subcellular localization of HcBD and HcBZL primarily to the cytoplasm of the plant cell helped postulate the trafficking of reaction intermediates of the CoA-dependent non-ß-oxidative route from the peroxisomes to the cytoplasm of the plant cell.Xanthone sind Polyketide mit erstaunlichen pharmakologischen Wirkungen. In Elicitor-behandelten Zellkulturen von Hypericum calycinum (Hc) akkumulieren prenylierte Xanthone. Benzoyl-CoA wird für den ersten Schritt ihrer Biosynthese benötigt. In Hypericum erfolgt die Bildung von Benzoyl-CoA auf dem CoA-abhängigen nicht-ß-oxidativen Weg. Dieser Weg wurde bisher biochemisch nachgewiesen, aber auf molekularer Ebene konnte nur eine peroxisomale Cinnamat:CoA-Ligase (CNL) definiert werden. Die molekulare Information über die verbleibenden Gene in dem Weg blieb unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die cDNA-Klonierung, funktionelle Charakterisierung und subzelluläre Lokalisierung von Benzaldehyd-Dehydrogenase (BD) und Benzoat:CoA-Ligase (BZL) aus mit Hefeextrakt behandelten und dann Xanthone akkumulierenden Hc-Zellkulturen. BD und BZL katalysieren die Umwandlung von Benzaldehyd zu Benzoesäure bzw. Benzoesäure zu Benzoyl-CoA. Basierend auf öffentlich verfügbaren transkriptomischen Ressourcen und homologiebasierten Klonierungsstrategien wurde die erste pflanzliche BZL-cDNA in voller Länge isoliert. Die 1647 bp lange Sequenz kodierte für ein ca. 60 kDa lösliches Protein mit pI 6.6. Die cDNA für HcBD hatte eine 1506 bp lange Sequenz und kodierte für ein lösliches Protein mit einer Masse von 54,2 kDa je Untereinheit und einem pI von 6,01. Das Screening mit 10 potenziellen Substraten ergab, dass HcBD in erster Linie die Umwandlung von trans-Zimtaldehyd und Benzaldehyd in die entsprechenden Säuren katalysiert. Von 24 Substraten, die in einem Luciferase-basierten Substratspezifitätsansatz getestet wurden, war Benzoesäure die einzige durch HcBZL aktivierte aromatische Säure. Zusätzlich wurden auch kurzkettige C3-C7-Fettsäuren in ihre CoA-Thioester umgewandelt. Expressionsanalysen zeigten die Hochregulation von Transkripten sowohl für HcBD als auch HcBZL nach Hefeextraktbehandlung der Zellkulturen, die der Xanthonakkumulation vorausging. Der maximale Xanthongehalt war 4,7 mg/g Trockengewicht. Die Ergebnisse legen die in vivo Beteiligung der beiden Gene am CoA-abhängigen nicht-ß-oxidativen Weg nahe, der den Kohlenstofffluss vom Benzoesäure- zum Xanthon-Biosyntheseweg lenkt. Die subzelluläre Lokalisierung von HcBD und HcBZL hauptsächlich im Zytoplasma der Pflanzenzelle führte dazu, den Transport von Reaktionszwischenprodukten des CoA-abhängigen nicht-ß-oxidativen Wegs von den Peroxisomen zum Zytoplasma der Pflanzenzelle zu postulieren