Das Proteinnetzwerk des Rnf-Prolin-Reduktase-Komplexes, welches für die respiratorische Energiegewinnung in Clostridioides difficile benötigt wird

Metabolic processes are central to toxin formation and corresponding infection success of the Gram-positive, anaerobic gut pathogen C. difficile. The bacterium utilizes a unique amino acid- based fermentation (Stickland reaction) in conjunction with a membrane-spanning ion-pumping Rnf complex for ATP generation. Here, it was demonstrated by interactomics that one of the major enzymes of the reductive Stickland fermentation D-proline reductase forms a stable supercomplex with the Rnf complex. Other enzymes of Stickland fermentation (subunits of the glycine reductase), of ATP generation (F-type and V-type ATPase), of electron bifurcation (Bcd2/Etf), butanoate metabolism (e.g. Buk2, Cat2, Crt2 and SucD), glycolysis (e.g. Fba, Gap and Pyk) and the TCA cycle (e.g. PycA) are also members of the supercomplex. Correspondingly, a still viable rnfC mutant contained an almost inactive D-proline reductase, showed changes in cell morphology, flagella formation and toxin production. Detailed holistic Omics-based analyses of compensatory changes in gene regulation, the protein inventory and metabolite composition revealed a significant reprogramming of the overall cell physiology. The NAD+/NADH ratio was imbalanced, a compensatory upregulation of the butanoate metabolism and TCA cycle as well as changes in the amino acid pathways were observed. Finally, the rnfC mutant showed clear cut defects in the colonization of the host as tested in a mouse model. In summary, obtained results underscores the importance of the Rnf-proline reductase supercomplex for the infection by C. difficile.Im Gram-positiven, anaeroben Darmerreger C. difficile sind metabolische Prozesse zentral für die Toxinbildung und den damit verbundenen Infektionserfolg. Das Bakterium nutzt eine einzigartige, auf Aminosäuren basierende Fermentation (Stickland Reaktion) in Verbindung mit einem membranständigen, ionenpumpenden Rnf-Komplex zur ATP-Erzeugung. In dieser Arbeit wurde durch Interaktomik-Studien gezeigt, dass eines der wichtigsten Enzyme der reduktiven Stickland Fermentation, die D-Prolinreduktase, mit dem Rnf Komplex einen stabilen höher geordneten Superkomplex bildet. Weitere Enzyme der Stickland Fermentation (Untereinheiten der Glycinreduktase), der ATPase (F-Typ und V-Typ ATPase), der Elektronenbifurkation (Bcd2/Etf), des Butanoat Metabolismus (z.B. Buk2, Cat2, Crt2 und SucD), der Glykolyse (z.B. Fba, Gap und Pyk) und des TCA Zyklus (z.B. PycA) gehören ebenfalls zum Superkomplex. Eine in dieser Arbeit generierte noch lebensfähige rnfC Mutante hatte eine fast inaktive D-Prolinreduktase und zeigte Veränderungen in der Zellmorphologie, Geißelbildung und Toxinproduktion. Detaillierte Omics-basierende Analysen legten eine Veränderung der Genregulation, des Proteininventars und der Metabolitenzusammensetzung offen und erklärten so die signifikante Neuprogrammierung der gesamten Zellphysiologie in der rnfC Mutante. Darüber hinaus wurde ein Ungleichgewicht des NAD+/NADH-Verhältnis, eine kompensatorische Hochregulation des Butanoat-Stoffwechselweges sowie des TCA-Zyklus und eine starke Veränderung des Aminosäure-Stoffwechsels beobachtet. Abschließend zeigte die rnfC Mutante im Mausmodell deutliche Defizite in der Kolonisierung des Wirtes. Zusammenfassend unterstreichen die erzielten Ergebnisse die Relevanz des Rnf-Prolinreduktase Superkomplexes für die Infektion durch den Erreger C. difficile