Die strukturellen Prinzipien, die der Mo-Insertase-Funktionalität und dem Aufbau des Proteinkomplexes zugrunde liegen

Molybdenum (Mo) is a crucial component for the survival of most species due to its vital duty for Mo-dependent enzymes. In nature, Mo is not biologically active unless it is complexed with a distinctive scaffold referred to as molybdopterin (MPT) to form a Molybdenum cofactor (Moco). Molybdenum insertases (Mo-insertases) are crucial for the final step of Moco biosynthesis in a multistep pathway that is evolutionary conserved. These combine the functions of two domains, referred to as G- and E- domain. In eukaryotes, the two domains are fused together, however, in prokaryotes, they are separate entities. In Escherichia coli, these are annotated as MogA and MoeA, while both domains fused in Arabidopsis thaliana and Homo sapiens are referred to as Cnx1 and gephyrin, respectively. The synthesis of Moco relies on the complex formation of Mo-insertases in order to protect and exchange intermediates. Protein-protein interaction was shown previously in Arabidopsis thaliana as well as a long-standing hypothesis of a "hexagonal mesh" formation in the post synapse in mammals. The structure of the complex nor the full-length proteins was not previously identified in any species. This work presents the structure of Mo-insertase complex for MoeA-MogA, the full-length Cnx1 as well as gephyrin using crosslinking mass spectrometry (XL-MS), negative staining electron microscopy (negative staining EM) and computational modelling. For MoeA-MogA complex, Native Mass Spectrometry was done, giving insight into the stoichiometry and size of the complex. XL-MS and computational modelling showed how MogA would interact with MoeA, which was confirmed by negative staining EM. For full-length proteins, including Cnx1 and gephyrin, a novel approach was established to purify the protein complexes with minimal degradation products. XL-MS and computational modelling of Cnx1 showed 88 cross-links which hinted towards the G-domain to bind in two different orientations on the E-domain. These results elucidate the oligomerization of a possible mesh to be formed or a higher-order structure. Using the XL-MS results, the Cnx1 linker was ab initio modelled, as well as a possible MPT synthase - Cnx1 complex. Additionally, in order to understand more about the metabolic exchange between domains, site-directed mutagenesis was done to highlight the essential residues involved in complex formation. Preliminary results of the direct interaction of Mo-insertases with Moco-dependent enzyme was shown using crosslinking. Finally, the interaction between E- and G- domain of the human gephyrin was prevailed using negative staining EM and modelling.Molybdän (Mo) ist aufgrund seiner lebenswichtigen Pflicht für Mo-abhängige Enzyme eine entscheidende Komponente für das Überleben der meisten Arten. In der Natur ist Mo nicht biologisch aktiv, es sei denn, es ist mit einem charakteristischen Gerüst, das als Molybdopterin (MPT) bezeichnet wird, komplexiert, um einen Molybdän-Cofaktor (Moco) zu bilden. Molybdän-Insertasen (Mo-Insertasen) sind entscheidend für den letzten Schritt der Moco-Biosynthese in einem mehrstufigen Weg, der evolutionär konserviert ist. Diese kombinieren die Funktionen von zwei Domänen, die als G- und E-Domänen bezeichnet werden. Bei Eukaryoten sind die beiden Domänen miteinander verschmolzen, bei Prokaryoten sind sie jedoch getrennte Einheiten. In Escherichia coli werden diese als MogA und MoeA bezeichnet, während beide in Arabidopsis thaliana und Homo sapiens fusionierten Domänen als Cnx1 bzw. Gephyrin bezeichnet werden. Die Synthese von Moco beruht auf der komplexen Bildung von Mo-Insertasen, um Zwischenprodukte zu schützen und auszutauschen. Eine Protein-Protein-Wechselwirkung wurde zuvor in Arabidopsis thaliana sowie eine langjährige Hypothese einer "hexagonalen Maschen" -Bildung in der Post-Synapse bei Säugetieren gezeigt. Die Struktur des Komplexes oder der Proteine voller Länge wurde bisher bei keiner Spezies identifiziert. Diese Arbeit präsentiert die Struktur des Mo-Insertase-Komplexes für MoeA-MogA, das Cnx1 in voller Länge sowie Gephyrin unter Verwendung von Vernetzungsmassenspektrometrie (XL-MS), negativer Färbungselektronenmikroskopie (negative Färbung EM) und Computermodellierung. Für den MoeA-MogA-Komplex wurde eine native Massenspektrometrie durchgeführt, die Einblick in die Stöchiometrie und Größe des Komplexes gab. XL-MS und Computermodellierung zeigten, wie MogA mit MoeA interagieren würde, was durch negative EM-Färbung bestätigt wurde. Für Proteine voller Länge, einschließlich Cnx1 und Gephyrin, wurde ein neuer Ansatz etabliert, um die Proteinkomplexe mit minimalen Abbauprodukten zu reinigen. XL-MS und Computermodellierung von Cnx1 zeigten 88 Vernetzungen, die darauf hindeuteten, dass die G-Domäne in zwei verschiedenen Orientierungen an der E-Domäne bindet. Diese Ergebnisse erklären die Oligomerisierung eines möglicherweise zu bildenden Netzes oder einer Struktur höherer Ordnung. Unter Verwendung der XL-MS-Ergebnisse wurde der Cnx1-Linker von Anfang an sowie ein möglicher MPT-Synthase-Cnx1-Komplex modelliert. Um mehr über den Stoffwechselaustausch zwischen Domänen zu erfahren, wurde außerdem eine ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um die wesentlichen Reste hervorzuheben, die an der Komplexbildung beteiligt sind. Vorläufige Ergebnisse der direkten Wechselwirkung von Mo-Insertasen mit Moco-abhängigen Enzymen wurden unter Verwendung von Vernetzung gezeigt. Schließlich wurde die Wechselwirkung zwischen der E- und der G-Domäne des menschlichen Gephyrins unter Verwendung von EM mit negativer Färbung und Modellierung überwunden