Efeitos de anti-inflamatórios não-esteroidais em modelo de glioblastoma humano : modulação da agressividade tumoral e da expressão do gene RECK

Orientadora: Prof.ª Drª. Sheila Maria Brochado WinnischoferDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 04/08/2022Inclui referências: p. 89-98Resumo: Glioblastomas (GB), tumores originados de astrócitos com elevado grau de malignidade, são as neoplasias mais comuns que acometem o sistema nervoso central. A baixa taxa de sobrevida pode ser atribuída à natureza altamente difusa e invasiva deste tipo tumoral, bem como a limitações no regime terapêutico. O tratamento quimioterápico padrão é feito com temozolomida (TMZ), porém diversos mecanismos de resistência à ação deste fármaco já são conhecidos. Sabe-se que a presença de células-tronco de glioblastoma (GSCs) no microambiente tumoral confere resistência ao tratamento e que esta subpopulação pode ser experimentalmente enriquecida através de técnicas de cultivo celular tridimensional para a formação de esferoides. A glicoproteína RECK, forma canônica codificada pelo gene supressor de tumor de mesmo nome, apresenta caráter antitumoral por inibir processos de invasão e migração mediados pela ação de MMP-2. Contudo, variantes de RECK produzidos por splicing alternativo, a exemplo de RECKvar3 e RECKvar5, correlacionam-se a fenótipos opostos ao da proteína canônica. Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) apresentam atividade antitumoral e alguns representantes desta classe foram descritos como capazes de induzir a expressão de RECK, ainda que por mecanismos não totalmente elucidados. Desta maneira, este trabalho destinou-se a avaliar a capacidade de AINEs de modular características de agressividade tumoral e responsividade ao tratamento quimioterápico com TMZ, bem como de modular a expressão do gene RECK em linhagens de GB humano. Foram observadas reduções na atividade metabólica e na população de células aderidas mediante o tratamento das linhagens U87MG e T98G com aspirina (AAS) e, de maneira mais sensível, com ibuprofeno (IBU). Interessantemente, a capacidade de formação de esferoides na presença de AAS foi reduzida em ambas as linhagens, enquanto o tratamento com IBU teve efeito somente na linhagem T98G. Ambos os AINEs promoveram redução da capacidade de migração, com o efeito mais pronunciado para a linhagem U87MG. Observou-se, ainda, que o cotratamento de AAS ou IBU com TMZ é capaz de sensibilizar a linhagem T98G, que é intrinsecamente resistente à ação deste quimioterápico. A análise de qRT-PCR revelou que AAS e IBU reprimem a expressão de MMP-2 e induzem a expressão de RECK canônico em ambas as linhagens. Destaca-se o tratamento com IBU por promover aumento da expressão do transcrito canônico de RECK, redução dos transcritos alternativos RECKvar3 e RECKvar5, redução da expressão proteica de MMP-2. A regulação da expressão de RECK e MMP-2 por AAS e IBU pode ser parcialmente explicada pelos menores níveis da forma fosforilada de ERK. Por fim, observou-se uma menor atividade de MMP-2 na linhagem U87MG tratada com ambos os AINEs, evidenciando que esta classe de fármacos pode atuar na regulação da expressão de MMP-2 em diferentes níveis. Em conjunto, os resultados obtidos neste projeto reforçam o potencial de AINEs na terapia antineoplásica e fornecem evidências de novos mecanismos de ação para AAS e IBU no contexto tumoral.Abstract: Glioblastomas (GB), tumors originating from astrocytes with a high degree of malignancy, are the most common neoplasms that affect the central nervous system. The low survival rate can be attributed to the highly diffuse and invasive nature of this tumor type, as well as limitations in the therapeutic regimen. The standard chemotherapy treatment is done with temozolomide (TMZ), but several mechanisms of resistance to the action of this drug are already known. It is known that the presence of glioblastoma stem cells (GSCs) in the tumor microenvironment confers resistance to treatment and that this subpopulation can be experimentally enriched through three-dimensional cell culture techniques for the formation of spheroids. The RECK glycoprotein, the canonical form encoded by the tumor suppressor gene of the same name, has an antitumor activity by inhibiting invasion and migration processes mediated by the action of MMP-2. However, variants of RECK produced by alternative splicing, such as RECKvar3 and RECKvar5, correlate with phenotypes opposite to that of the canonical protein. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) also have antitumor activity and some representatives of this class have been described as capable of inducing RECK expression, although by mechanisms not fully elucidated. Thus, this work aimed to evaluate the ability of NSAIDs to modulate tumor aggressiveness and responsiveness to chemotherapy with TMZ, as well as to modulate RECK expression in human GB cell lines. Reductions in metabolic activity and adherent cell population were observed upon treatment of the U87MG and T98G cell lines with aspirin (AAS) and, more sensitively, with ibuprofen (IBU). Interestingly, the ability to form spheroids in the presence of AAS was reduced in both cell lines, while IBU treatment only affected the T98G cells. Both NSAIDs promoted reduced migration capacity, with the most pronounced effect for U87MG. It was also observed that the co-treatment of AAS or IBU with TMZ is capable of sensitizing the T98G cell line, which is intrinsically resistant to the action of this chemotherapeutic agent. qRT-PCR analysis revealed that AAS and IBU repress MMP-2 expression and induce RECK expression in both cell lines. The treatment with IBU stands out for promoting increased expression of the canonical transcript of RECK, reduction of RECKvar3 and RECKvar5 transcripts and reduction of the protein expression of MMP-2. Regulation of RECK and MMP-2 expression by AAS and IBU can be partially explained by lower levels of phosphorylated ERK. Finally, a lower MMP-2 activity was observed in U87MG cells treated with both NSAIDs, evidencing that this class of drugs can act in the regulation of MMP-2 expression at different levels. Taken together, the results obtained in this project reinforce the potential of NSAIDs in anticancer therapy and provide evidence of new mechanisms of action for AAS and IBU in the tumor context