Multitrophic interaction of co-inoculated endophyte entomopathogenic fungi

Entomopathogene Pilze als natürlicher Antagonist von herbivoren Insekten werden in der Regel in einzelnen Anwendungsstrategien angewendet; jedoch kann eine Kombination mehrerer Antagonisten die Kontrollwirksamkeit von Herbivoren und Pflanzenpathogenen im Vergleich zu einer einzelnen Antagonisten-Anwendung verbessern. Antagonistenkombinationen können in unterschiedlichen Zeitintervallen oder unter unterschiedlichen Bedingungen Schutz bieten, verschiedene Nischen besetzen und sich gegenseitig ergänzen. Diese Forschung wurde als erster Schritt in Richtung des möglichen Vorteils der Kombination verschiedener Antagonisten im Zellstoff (als Endophyten) durchgeführt und verbessern die Wirksamkeit als biologische Kontrollmittel. Die Forschung konzentriert sich auf die Impfung von Stämmen der entomopathogenen Pilze Beauveria bassiana und Metarhizium brunneum als eine einzige Endophytenanwendung und als eine kombinierte Anwendung durch Wurzelinokulation-Sporen-Suspension-Methode in Tomaten (Kultursorte: Moneymaker) und die Bewertung der Auswirkungen auf Endophyten-Gemeinschaft im Zellstoff, Pflanzenpathogen, Insektenpflanzenfresser und der natürliche Feind (Parasitoid). Diese Forschung trägt dazu bei, die multitrophische Wechselwirkung von Pflanzen-Endophyten-Insektenplanzenfresser-natürlichen Feind zu offenbaren, wie die drei Hauptthemen beschreiben: I. Bewertung der Wirkung der Co-Inokulation entomopathogener Pilze auf die Gemeinschaftsstruktur der Pflanzenendophyten Das Experiment zielte darauf ab, die Fähigkeit der entomopathogenen Pilze zu bewerten, Tomatenpflanzengewebe als Kombination durch zwei verschiedene Methoden zu besiedeln, (i) Sequenz (Ko-Inokulation durch einzelnen Pilz) und (ii) Simultane (gleichzeitige Impfung von Pilzstämmen) durch Wurzeleintauchen von Sporensuspensionen. Und wie diese Pilzkombinationen die Pilz- und Bakteriengemeinschaft in Pflanzengeweben beeinflussen. Um die endophytische Fähigkeit dieser Pilze zu bewerten und die Pilzgemeinschaften in der Endosphäre zu bestimmen, wurden die Sonden durch einen verschachtelten PCR-Ansatz untersucht, der auf die ITS-Region abzielte. Bakterielle endophytische Gemeinschaften wurden auch durch einen verschachtelten PCR-Ansatz bewertet, der auf das 16S rRNA-Gen abzielte. Gereinigte PCR-Produkte wurden mit der Next Generation Sequencing (NGS)-Methode mit Barcodes versehen. Entomopathogene Pilzstämme waren in der Lage, endophytisch Tomatenpflanzengewebe zu besiedeln. Die Anzahl der Pilzinokulationen und der verwendeten Pilzstämme beeinträchtigt signifikant Pilze und bakterielle Endophytenvielfalt, vor allem in den Wurzeln. Die Impfung der Pilzbehandlung hat einen signifikanten Einfluss auf den Wurzelreichtum und die Vielfalt der Pilz- und Bakteriengemeinschaft. II. Co-Inokulation von endophyten entomopathogenen Pilzen (EEF) Wirkung auf Pflanzenpathogenhemmung. Das Experiment zielte darauf ab, die Fähigkeit der entomopathogenen Pilze zu bewerten; i) das Tomatenpflanzengewebe durch gleichzeitige Inokulationsmethode endophytisch zu besiedeln und (ii) das Wachstum des Pflanzenpathogens zu hemmen. Die Experimente wurden durch inokulierte Stämme der entomopathogenen Pilze Beauveria bassiana und Metarhizium brunneum durchgeführt, gefolgt von einer Inokulation mit einem Pflanzenerreger (F. oxysporum) 24 Stunden später. Quantitative PCR (QPCR) mit artspezifischer Grundierung wurde durchgeführt, um das Vorhandensein jedes inokulierten Pilzes in Tomatenpflanzengeweben zu quantifizieren. Erhebliche Mengen an Piktogramm-DNA von B. bassiana und M. brunneum wurden meist in Wurzeln gefunden, während die Stämme nur marginal endopyhtisch von diesen Stämmen kolonisiert wurden. Die geimpften entomopathogenen Pilze konnten das Wachstum des Pflanzenpathogens im Vergleich zu einzelnen Inokulationen hemmen. III. Präferenztest für Insektenpflanzenfresser und Parasitoid gegenüber volatilen Pflanzeneigenschaften Das Experiment zielte darauf ab, die Wirkung von inokulierten endophyten entomopathogenen Pilzen (EEF) auf Präferenzen von zu bewerten; i) Insektenpflanzenfresser (Gewächshaus-Weißfliegen, Trialeurodes vaporariorum) und (ii) das Gewächshaus Whiteflies parasitoid (Encarsia formosa) beeinflusst durch pflanzlicheflüchtige organische Verbindungen (VOCs). Ein sechsärmiges Olfactometer-System wurde mit den Behandlungen von geimpften EEF (einschließlich Kontrolle) entwickelt, die VOCs jedes Arms wurden mit Super-Q Adsorbent Filter gesammelt und darüber hinaus von GC-MS analysiert. Es wurden 17 VOCs und 20 VOCs auf Weißfliegen bzw. Parasitoid-Präferenztests identifiziert. Mit der signifikanten Menge an P-Cymen, Beta-Phellandren, Caryophyllen und Dodecanal sowie diese Verbindung trägt zu einer positiven Korrelation der Weiße Fliege Präferenzen auf geimpften EEF-Pflanzen. Parasitisierungsrate von Encarsia formosa auf Weißfliegen Nymphe instar 2-3 sind bis zu 97% in EEF inokulierten Pflanzen. Entomopathogene Pilzstämme wurde in diesem Experiment verwendet, entweder als Einzel-oder Co-Inokulation waren sie in der Lage, infizierte Site-Bereiche (Wurzeln) als Einstiegspunkt der Inokulation zu besiedeln. Das Vorhandensein von Inokulumraten von Pilzstämmen beeinflussen folglich die (i) pflanzlichen Endophytenpilz- und bakteriellen Gemeinschaftsstrukturen, (ii) die Fähigkeit, das Wachstum des Pflanzenpathogens zu hemmen, (iii) VOCs, die von geimpften Pflanzen emittiert werden, und (iv) Präferenzen von Insekten Pflanzenfresser und ihr natürlicher Feind. Die Entwicklung eines biologischen Kontrollmittels, das eine Mischung entomophatogener Pilze enthält, könnte eine praktikable Option für eine mögliche wirksame Bekämpfung von Schädlingen und Pflanzenkrankheit in Kulturpflanzen sein.The application of entomopathogenic fungi (EPF) as biocontrol agents of insect herbivores is constrained by their limited efficacy due to high sensitivity to UV-light radiation, water leaching, and fungicide application. In order to overcome these constraints and to enhance the efficacy of entomopathogenic fungi as biocontrol agents, a possible way would be the introduction of these fungi into crop plants tissues as endophytes thus helping to overcome the environmental instability obstacle and building up a systemic protection against insect herbivores. Entomopathogenic fungi are typically applied in single application strategies; however, a combination of multiple antagonists may improve the control efficacy of insect herbivores compared to single antagonist applications. Antagonist combinations might provide protection at different time intervals or under different conditions, occupying different niches and complementing each other. This study focusing on the establishment of EPF, such as Beauveria bassiana or Metarhizium brunneum, as combined applications is so far limited. By using a root immersion inoculation method of the spore suspensions, we assessed the effects of these treatments towards the establishment of an endophyte fungal community in tomato plants (cultivar: Moneymaker), and evaluated the effects on plant pathogens, insect herbivores and their parasitoid species. Our research confirmed that both B. bassiana and M. brunneum strains were able to establish in the tomato plants as endophyte either as a single species or as species combination inoculation. The co-inoculation method for species combination either with sequence or simultaneous inoculation method were affecting the endogenous bacterial and fungal community of host plant within the root, stem, and leaf. The predominant bacterial genera found were Ralstonia, followed by Rhodanobacter, and Pseudomonas in both inoculation method. Fungal genera were dominated by the genus Pseudogymnoascus, Chalastospora, Cladosporium, and Mycosphaerella in the sequence inoculation. Fungal genera of the genus Chalastospora, Pseudogymnoascus, Olpidium, and Mycosphaerella were dominance in simultaneous inoculation method. Bacterial diversity and abundance from both inoculation method was significantly different between plant compartment, with higher value in the roots than in the stem or leaves and simultaneous inoculation method significantly increased bacterial abundance. The higher bacterial diversity reported when inoculating simultaneously instead of sequentially. In contrast, there was no significant effect of the plant compartment on fungal diversity, but a simultaneous inoculation method induced a significant effect on fungal diversity and abundance. Our result finding that the simultaneous inoculation significantly increased both bacterial and fungal abundance and diversity. Similarly, the structures of the microbial communities were affected in all plant compartments. The combination of B. bassiana and M. brunneum strains were able to inhibit fungal plant pathogen Fusarium oxysporum Schlechtendahl Race 3 and provided protecting effect towards plant growth parameters. Significant amounts of both EPF species were found in roots. Successful EPF colonization in tomato plant tissues affected plant volatile compound profiles qualitatively and influenced insect’s response. The most abundant plan volatile compound in all EPF inoculation treatments was β-Phellandrene. Tetradecanal was the plant volatile compound correlated with the responses of the greenhouse whiteflies (Trialeurodes vaporariorum) and their parasitoid (Encarsia formosa). VOCs emitted from plants inoculated with a combination of the two EPF strains tested were less preferred by greenhouse whiteflies and E. formosa parasitoid in the olfactometer tests. High parasitization rate of E. formosa on GHW larvae instar 3 of all EPF inoculation treatment indicating that EPF application as endophyte are compatible with the parasitoid E. formosa and could be an option for GHW control. The development of a biological control with the mixture of EPF species introduced as endophyte within tomato in this study was a novel approach and it could be a viable option for the alternative management of pests and plant diseases in crop plants.2022-07-2