Molecular causes for symptom expression of beet necrotic yellow vein virus in Beta vulgaris

Beta vulgarisBeet necrotic yellow vein virus (BNYVV) löst Rizomania aus, die wichtigste Viruserkrankung im Zuckerrübenanbau. Typische Symptome einer Rizomania Erkrankung ist ein verkleinerter Rübenkörper, Vergilbung und Nekrose entlang der Blattadern und, besonders charakteristisch, die so genannte Wurzelbärtigkeit, eine massive Proliferation der Seitenwurzeln. Der Hauptteil dieser Arbeit, war die Untersuchung der, durch BNYVV ausgelösten Wurzelbärtigkeit auf molekularer Ebene. Die Wurzel-Organogenese ist unter anderem durch den Auxin-vermittelten Abbau von Aux/IAA-Transkriptionsrepressoren reguliert. In diesen Mechanismus greift BNYVV, genauer der Pathogenitätsfaktor p25 ein, indem er mit BvIAA28 (AUX28) interagiert einem Aux/IAA Protein aus Beta vulgaris, welches an der Initiation der Wurzelentwicklung beteiligt ist. Vorherige Arbeiten, die die Interaktion von p25 mit BvIAA28 charakterisiert haben, zeigen, dass p25 die nukleare Lokalisierung von BvIAA28 hemmt. Da Aux/IAA Proteine direkt an der DNA lokalisiert sein müssen, um die Transkription zu regulieren, können diese Proteine im Zytoplasma nicht mehr als Transkriptionsrepressoren agieren. Dadurch kommt es zu einer übermäßigen Initiation der Seitenwurzeln und schlussendlich zu einem Wurzelbart. Es war jedoch bislang nicht klar, ob p25 auch mit anderen Aux/IAA-Proteinen interagiert. Mit Hilfe von bioinformatischen Tools wie auch In-vitro- und In-vivo Proteininteraktionsansätzen konnten wir zeigen, dass p25 zusätzlich mit BvIAA2 und BvIAA6 interagiert. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass die BNYVV-Infektion tatsächlich mit einem erhöhten Auxinlevel in infizierten Seitenwurzeln einhergeht. Dennoch blieben die Expressionsniveaus von BvIAA2, BvIAA6 und BvIAA28 nach einer BNYVV-Infektion unverändert, obwohl sie durch ein erhöhten Auxinlevel hochreguliert werden müssten. Mutationsanalysen zeigten, dass die Interaktion von p25 mit BvIAA2 oder BvIAA6 Proteine in voller Länge erfordert, selbst der Austausch einzelner Aminosäuren führt zu einem Interaktionsverlust. Im Gegensatz zur Interaktion zwischen p25 und BvIAA28, die zu einer Veränderung der Lokalisation von BvIAA28 ins Zytoplasma führt, blieben sowohl BvIAA2 als auch BvIAA6 unabhängig von der Anwesenheit von p25 auf den Zellkern beschränkt, was auf ihre Stabilisierung durch die Interaktion mit p25 hindeutet. Die heterologe Expression der Interaktionspartner von p25 (BvIAA2, BvIAA6 und BvIAA28) in Nicotiana benthamiana führte zu einem Auxin-unempfindlichen Phänotyp, der durch Zwergwuchs und eine drastisch reduzierte Entwicklung der Seitenwurzeln gekennzeichnet ist. Diese Arbeit bestätigt, dass BNYVV in den Auxin-Signalweg der Zuckerrübe eingreift und somit den Wurzelbart induziert. Außerdem konnten zwei zusätzliche Interaktionspartner von p25 identifiziert werden, BvIAA2 und BvIAA6, die aber scheinbar auf andere Weise als BvIAA28 mit p25 interagieren. Ein weiterer Teil dieser Arbeit war die Untersuchung eines der BNYVV-Pathotypen. Insgesamt sind vier verschiedene BNYVV-Pathotypen bekannt, der A-, B-, P- und J-Typ. Diese Typen unterscheiden die sich in ihrer RNA Sequenzen und dem Verbreitungsgebiet. Alle Typen haben vier RNAs, bis auf der P- und J-Typ. Sie besitzen eine fünfte RNA, auf der p26 codiert ist, ein Pathogenitätsfaktor, der vermutlich für eine Symptomverstärkung in der Zuckerrübe verantwortlich ist. Aktuell wird Rizomania durch zwei Resistenzgene, Rz1 und Rz2 kontrolliert allerdings haben sich aufgrund eines starken Selektionsdrucks bereits Rz1- resistente Varianten des A- und P-Typs auf dem Feld verbreitet. Die Eingeschalten des A Typs im Bezug auf Symptomausprägung und Resistenzbruch wurden bereits eingehend mithilfe eines infektiösen cDNA Klons untersucht, doch alle Ergebnisse über den P-typ wurden bisher lediglich über natürliche Infektion mit infektiösem Boden oder über Reassortanten mit dem A-Typ generiert. Daher war es ein Hauptziel dieser Studie einen infektiösen cDNA Klon des P-Typs zu generieren und die Sachverhalte erneut unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Nachdem die Infektiosität des Klons in Beta vulgaris, Nicotiana benthamiana und Beta macrocarpa mit einer mechanischen Inokulationsmethode nachgewiesen wurde, untersuchten wir die resistenzbrechenden Eigenschaften dieses Klons von Rz1 und Rz2, den Einfluss von RNA5 und den durch den P-Typ verursachten Wurzel und Blatt Phänotyp. Obwohl die Inokulationsversuche mit dem P-Typ zeigten, dass die Blattsymptome stärker ausgeprägt waren als beim A-Typ, waren keine Unterschiede in der Entwicklung des Wurzelbarts feststellbar. Wir konnten zeigen, dass der P-Typ die Rz1-Resistenz überwinden kann, nicht aber die Rz2-Resistenz. Reassortantenversuche zeigten, dass RNA5 nicht für die resistenzbrechenden Eigenschaften des P-Typs verantwortlich ist, dessen Vorhandensein jedoch zu einer höheren Infektionsrate von Rz1-resistenten Zuckerrüben führt. Zusätzlich konnte mit einem in-silico Vergleich aller BNYVV Typen und Reassortanten mit dem A-Typ eine nahe Verwandtschaft des A- und P-Typ bewiesen und neue Erkenntnisse über die evolutionären Verwandtschaftsbeziehungen gesammelt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass infektionsfördernde Eigenschaften von RNA5 des P-Typs nachgewiesen werden konnten, allerdings nicht in Bezug auf die Ausprägung von Wurzelsymptomen, sondern in Bezug auf die Infektionsrate bei Rz1 resistenten Pflanzen und wie auch die Ausprägung von Blattsymptomen.Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) is the causal agent of rhizomania, the most important viral disease in sugar beet cultivation. Typical symptoms of rizomania disease is a reduced taproot, yellowing and necrosis along the leaf veins and, particularly characteristic, the so-called root beard, a massive proliferation of the lateral roots. A main part of this study was the investigation of root beard development, induced by BNYVV, at the molecular level. Root organogenesis is regulated by auxin-mediated degradation of Aux/IAA transcriptional repressors. BNYVV, more specifically pathogenicity factor p25, interferes with this mechanism by interacting with BvIAA28 (AUX28) an Aux/IAA protein from Beta vulgaris involved in the lateral root initiation. Previous works characterized the interaction of p25 with BvIAA28 and showed that p25 inhibits the nuclear localization of BvIAA28. Since Aux/IAA proteins must localize directly at the DNA to regulate gene transcription, these proteins can no longer act as transcriptional repressors in the cytoplasm which results in excessive lateral root initiation and leads to a root beard. However, it was not clear whether p25 also interacts with other Aux/IAA proteins. Using bioinformatic tools as well as in-vitro and in-vivo protein interaction approaches, we demonstrated that p25 additionally interacts with BvIAA2 and BvIAA6. Furthermore, we confirmed that BNYVV infection is indeed associated with an increased auxin level in infected lateral roots. Nevertheless, the expression levels of BvIAA2, BvIAA6, and BvIAA28 remained unchanged after BNYVV infection, although they should be upregulated by increased auxin levels. Mutational analyses revealed that the interaction of p25 with BvIAA2 or BvIAA6 required full-length proteins, as even single amino acid residue substitutions abolished the interactions. In contrast to the interaction between p25 and BvIAA28, which results in redistribution of BvIAA28 to the cytoplasm, both BvIAA2 and BvIAA6 remained confined into the nucleus regardless of the presence of p25, suggesting their stabilization through interaction with p25. Heterologous expression of the p25-interacting partners (BvIAA2, BvIAA6, and BvIAA28) in Nicotiana benthamiana resulted in an auxin-insensitive phenotype characterized by plant dwarfism and dramatically reduced lateral root development. This work confirms that BNYVV interferes with the auxin signaling pathway in sugar beet, inducing the root beard. Furthermore, two additional interaction partners of p25 could be identified, BvIAA2 and BvIAA6, but as they seem to interact with p25 in a different way than BvIAA28. Another part of this work was the investigation of one of the BNYVV pathotypes. A total of four different BNYVV pathotypes are known, the A-, B-, P- and J-type. These types differ in their RNA sequences and the area of distribution. All types have four RNAs, except for the P and J-type. The have a fifth RNA, encoding p26 which is probably responsible for symptom enhancing in sugar beet. Currently, rizomania is controlled by two resistance genes, Rz1 and Rz2, but due to strong selection pressure, Rz1-resistant A- and P-type variants have already spread in the field. The mechanisms of the A-type in terms of symptom expression and resistance breaking have already been studied in detail using an infectious cDNA clone, but all results of the P-type relied on natural infection with infectious soil or reassortants with the A-type. Therefore, a major objective of this study was to generate an infectious cDNA clone of the P-type and re-examine the facts. After demonstrating the infectivity of the clone in Beta vulgaris, Nicotiana benthamiana, and Beta macrocarpa using mechanical inoculation, we investigated the resistance-breaking properties of this clone of Rz1 and Rz2, the impact of RNA5, and the phenotype caused by the P-type under controlled greenhouse conditions. Although inoculation experiments with the P-type showed that leaf symptoms were more severe, compared to the A-type, no differences in root beard development were detectable. We demonstrated that the P-type overcomes Rz1 resistance, but not Rz2 resistance. Reassortant experiments revealed that RNA5 is not responsible for the resistance-breaking properties of the P-type, but its presence leads to a higher infection rate of Rz1-resistant sugar beets. In addition, an in-silico comparison of all BNYVV types and reassortants with the A-type proved a close relationship of the A- and P-type and provided new insights into evolutionary relationships. In summary, infection-promoting properties of P-type RNA5 were demonstrated, but not in relation to the expression of root symptoms, but in relation to the infection rate of Rz1-resistant plants and the development of foliar symptoms.2022-07-2