T CD4+ and T CD8+ lymphocytes proliferation, and their memory subpopulations, in dairy cows with distinct history of Staphylococcus aureus mastitis

A mastite bovina é a doença de maior impacto negativo na pecuária leiteira devido à diminuição da produção e qualidade do leite e produtos lácteos. Staphylococcus aureus é um dos mais importantes patógenos da mastite bovina devido à sua patogenicidade, contagiosidade e refratariedade ao tratamento antimicrobiano, além de questões críticas relacionadas à segurança alimentar e saúde pública. Há cada vez mais evidências de que a defesa contra S. aureus depende dos linfócitos T. Diante deste cenário, a comparação da resposta de linfócitos T em animais sadios que foram expostos ao patógeno e permaneceram sadios com animais que não permaneceram sadios (infectados por S. aureus) pode nos ajudar a identificar respostas imunes associadas a resistência à infecção, ou seja respostas imunes que conferem proteção contra este patógeno, aqui avaliada pela capacidade de proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ sanguíneos, e sua população de memória, estimulados ou não com S. aureus. Ademais, o presente estudo nos permitiu avaliar estas respostas imunes em dois momentos em animais vacinados ou não com vacina comercial. Para a realização deste estudo, amostras de sangue periférico de 25 animais foram coletadas antes do início do protocolo vacinal (D0) e após 21 dias da última dose vacinal (D118). As células mononucleares do sangue periférico foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll, e em seguida, foi realizada a proliferação de linfócitos na ausência (basal) e presença de isolado de S. aureus inativado pelo calor proveniente de caso mastite bovina persistente. A proliferação de linfócitos foi determinada pela expressão de Ki67 por citometria de fluxo. Para a identificação das populações de linfócitos, a imunofenotipagem foi realizada por citometria de fluxo com os seguintes anticorpos monoclonais: CD4, CD8, CD45R0, CD44 e CD62L. No presente estudo identificamos que vacas infectadas por S. aureus apresentaram menor proliferação de linfócitos, linfócitos T CD4+ e linfócitos de memória geral quando estimulados com isolado de S. aureus. Ademais, nenhum efeito da vacinação na proliferação das populações de linfócitos sanguíneos foi observado. No entanto, observamos que a proliferação de linfócitos T CD8+ , linfócitos T CD8+ de memória indiferenciável e linfócitos T CD8+ de memória efetora foi maior no primeiro momento que no segundo momento. Desta forma, concluímos que a regulação negativa da reposta de células T frente à estimulação por S. aureusé crucial para a persistência das infecções intramamárias por S. aureus, e que a ausência da resposta vacinal na proliferação de linfócitos T pode justificar a insatisfatória resposta à vacinação encontrada a campo.Bovine mastitis is the disease that has the greatest negative impact on dairy farming, since it results in a drop in milk production and quality. Staphylococcus aureus is a significant pathogen of bovine mastitis due to its pathogenicity, contagiousness, and refractoriness to antimicrobial treatment, as well as critical issues related to food safety and public health. There is growing evidence that the protective immune defense against S. aureusdepends on T cells. In this scenario, comparing the T lymphocyte response in healthy animals exposed to the pathogen and remaining healthy versus animals that did not remain healthy (infected with S. aureus) can aid in identifying immune responses associated with resistance to infection, that is, immune responses that provide protection against this pathogen, as measured here by the proliferation capacity of CD4+ and CD8+ blood T lymphocytes, as well as their memory population, under stimulation with S. aureus, as without any stimulation (control). Additionally, the current investigation enabled us to analyze these immune responses in animals that had been vaccinated or had not been immunized with a commercial vaccine at two points in time. To conduct this investigation, peripheral blood samples were taken from 25 animals before and 21 days following the initiation of the immunization procedure (D0) (D118). Ficoll density gradient separation was used to isolate peripheral blood mononuclear cells, and subsequently lymphocyte proliferation was performed in the absence (baseline) and presence of a heat-inactivated S. aureusisolate from chronic bovine mastitis. Lymphocyte proliferation was measured by flow cytometry and immunophenotyping with the following monoclonal antibodies: CD4, CD8, CD45R0, CD44, and CD62L was used to identify lymphocyte populations. In the present study we found S. aureus-infected cows had an inhibition on lymphocyte, T CD4+ lymphocyte, and memory lymphocyte proliferation when stimulated with S. aureus. Furthermore, immunization had no influence on the expansion of blood lymphocyte populations. However, we noticed that the first moment resulted in higher proliferation of T CD8+ cells, memory T CD8+ lymphocytes, and effector memory T CD8+ lymphocytes than the second moment. Thus, we conclude that negative regulation of the T cell response is required for the persistence of S. aureusintramammary infections and that the absence of the vaccine response in T lymphocyte proliferation may account for the field′ s unsatisfactory response to vaccination