Molecular analysis of the active bacterial community in endodontic infections

Introdução: Como as bactérias ativas apresentam uma maior abundância de RNA ribossômico (rRNA) do que DNA (genes rRNA), a razão rRNA/DNA foi utilizada para investigar bactérias ativas em infecções endodônticas. No 1o experimento, a razão rRNA/DNA do sequenciamento de próxima geração (NGS) foi empregada para investigar a comunidade endodôntica ativa. No 2o experimento, a razão rRNA/DNA de ensaios de qPCR foi utilizada para investigar a atividade de bactérias específicas, antes e após o preparo químico-cirúrgico (PQC). Adicionalmente, foi realizada uma revisão sistemática e meta-análise para investigar a prevalência de bactérias ainda não cultivadas/difíceis de cultivar em amostras pós-preparo. Métodos: Amostras endodônticas coletadas antes (S1) e após o PQC (S2) foram submetidas à extração de DNA e RNA. Para a análise de NGS, DNA e RNA (cDNA) de 5 amostras S1 foram sequenciados usando MiSeq (Illumina, San Deigo, CA) e as diferenças analisadas pelo teste de Mann Whitney (P <0,05). A atividade metabólica de Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 e Selenomonas spp. foi determinada pela razão rRNA/DNA baseada nos enasios de qPCR de 20 amostras pareadas S1-S2. Para a revisão sistemática, foram incluídos estudos moleculares que identificaram espécies bacterianas antes e após o PQC. A meta-análise foi realizada com o RStudio. Resultados: Os dados de NGS revelaram que Bacteroidales [G-2] bacterium HMT 274, Porphyromonas endodontalis, Tannerella forsythia, Alloprevotella tannerae, Prevotella intermedia, Pseudoramibacter alactolyticus, Olsenella sp. HMT 809 e Olsenella sp. HMT 939 foram membros ativos (rRNA/DNA 1) nas infecções primárias. Os ensaios de qPCR revelaram que a concentração de cópias de rRNA de Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 nas amostras S2 foi maior do que os níveis correspondentes de DNA (P < 0,05). Por outro lado, houve uma redução da atividade de Selenomonas spp. após o PQC. Os resultados da revisão sistemática e meta-análise mostraram que a prevalência de espécies de difícil cultivo nas amostras pós-preparo foi baixa (<17%), sendo representadas principalmente por Firmicutes e Bacteroidetes. Conclusão: (1) a estratégia integrada de NGS baseada em DNA e rRNA foi particularmente importante para revelar a atividade de bactérias ainda não cultivadas; (2) Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 permaneceu metabolicamente ativo após o PQC; (3) bactérias de difícel cultivo são encontradas em baixa prevalência em amostras pós-instrumentação.Introduction: As active bacteria have a greater abundance of ribosomal RNA (rRNA) than DNA (rRNA genes), the rRNA/DNA ratio was used to investigate active bacteria in endodontic infections. In the 1st experiment, the rRNA/DNA ratio of Next Generation Sequencing (NGS) data was used to investigate the active endodontic community. In the 2nd experiment, the rRNA/DNA ratio of qPCR data was used to investigate the activity of specific bacteria, before and after chemocomechanical preparation (CMP). Additionally, a systematic review and meta-analysis was performed to investigate the prevalence of bacteria as-yet-uncultivated/ difficult-to-culture bacteria in post-instrumentation samples. Methods: Endodontic samples collected before (S1) and after CMP (S2) were submitted to DNA and RNA extraction. For NGS analysis, DNA and RNA from 5 S1 samples were sequenced using MiSeq (Illumina, San Deigo, CA) and analyzed by the Mann Whitney test (P < 0.05). The metabolic activity of Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 and Selenomonas spp. was determined by the rRNA/DNA ratio based on the qPCR of 20 paired S1-S2 samples. For the systematic review, molecular studies that identified bacterial species before and after PQC were included. The meta-analysis was performed with RStudio. Results: NGS data revealed that Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272, Porphyromonas endodontalis, Tannerella forsythia, Alloprevotella tannerae, Prevotella intermedia, Pseudoramibacter alactolyticus, Olsenella sp. HMT 809, Olsenella sp. HMT 939, Olsenella uli and Fusobacterium nucleatum subsp. animalis were active members (rRNA/DNA 1) in primary infections. qPCR assays revealed that the rRNA concentration of Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 in S2 samples was higher than the corresponding DNA levels (P < 0.05). On the other hand, there was a reduction in the activity of Selenomonas spp. after CMP. The results of the systematic review and meta-analysis showed that the prevalence of as-yet-uncultivated/ difficult-to-culture bacteria in post-instrumentation samples was low (