Analysis of HPV-18 transcriptional activity during cell differentiation

O ciclo de vida do papilomavírus humano (HPV) está intimamente ligado ao programa de diferenciação dos queratinócitos. O repertório de fatores de transcrição (FTs) expressos na célula hospedeira tem um papel crucial na coordenação da expressão gênica viral nas diferentes camadas do epitélio escamoso estratificado. Por sua vez, a expressão de oncogenes virais modifica o ambiente celular culminando, em última análise, na transformação tumorigênica da célula. O objetivo principal desse estudo foi investigar o papel de diferentes FTs durante o ciclo de vida viral, de modo a melhor elucidar as interações entre a célula hospedeira e o vírus. Inicialmente, comparamos o nível de 345 FTs em queratinócitos não diferenciados e diferenciados. Foram encontrados níveis diferenciais de 30 FTs. Em seguida, levando-se em consideração que os FTs capazes de se ligar diretamente à região longa de controle (LCR) têm uma influência potencialmente mais preponderante sobre a regulação da transcrição viral, procurou-se sítios de ligação putativos para os 30 FTs na LCR de HPV-18 utilizando ferramentas in sílico. Em seguida, a confirmação da ligação de FTs selecionados foi realizada com ensaios qPCR-ChIP. Assim, foi possível identificar a ligação de quatro FTs à LCR: HMGB1, PAX-6, FOXI1 e NF-E2. Prosseguiu-se com uma abordagem funcional que revelou que a co-transfecção transitória de cada um desses quatro FTs com um construto de pGL3-18LCR foi capaz de influenciar na atividade transcricional do promotor precoce do HPV-18 de maneira dose-dependente. Além disso, foi observada uma regulação diferencial desses FTs sobre a atividade do promotor de acordo com estado de diferenciação dos queratinócitos. Finalmente, foi demonstrado que a expressão das oncoproteínas do HPV-18 leva ao aumento dos níveis desses fatores. Além disso, a expressão dos FTs se mostrou variável de acordo com a transformação celular. Portanto, identificou-se quatro novos FTs celulares que podem ser potencialmente relevantes para a regulação da transcrição do HPV durante a diferenciação e transformação maligna. Expandir esse conhecimento contribui para melhor compreender a biologia e a patogênese das doenças associadas ao HPV-18The human papillomavirus (HPV) life cycle is tightly linked to the keratinocytes differentiation program. The repertoire of transcription factors (TFs) expressed in the host cell has a crucial role in coordinating viral gene expression throughout different layers of the stratified squamous epithelium. In turn, the expression of viral oncogenes modifies the cellular environment culminating ultimately in cell tumorigenic transformation. The main purpose of this study was to better understand the functional role of the host TFs composition in assisting the virus to complete the life cycle during infection. First, we compared the level of 345 TFs in undifferentiated and differentiated keratinocytes and found the differential expression of 30 TFs. Since TFs that have binding sites within the viral long control region (LCR) have a potentially stronger influence on viral transcriptional regulation, we search for putative binding sites for the 30 TFs within HPV-18 LCR with in silico tools and then confirmed the binding of selected TFs with qPCR-ChiP assays. Therefore, we identified four novel TFs binding sites within the LCR: HMGB1, PAX-6, FOXI1 e NF-E2. Further, the functional approach revealed that the transient co-transfection of each of these four TFs with a construct of pGL3-18LCR was able to impact the HPV-18 early promoter in a dose-dependent manner. In addition, we observed a differential regulation upon the promoter activity regarding the differentiation state of the keratinocytes. Finally, it was demonstrated that the HPV-18 oncoproteins expression leads to an increase in the levels of these factors. Additionally, their expression is variable according to the cell transformation. Therefore, we identified four new cellular TFs that may be potentially relevant for the regulation of HPV transcription during differentiation and malignant transformation. Expanding this knowledge contributes to a better understanding of the biology and pathogenesis of diseases associated with HPV-1