Biosurfactant from thermohalophilic strain of Bacillus alveayuensis: chemical characterization and evaluation of surface-activity in oily porous medium and on microorganisms

Biossurfactantes são moléculas anfifílicas provenientes de metabolismo secundário microbiano capazes de reduzir a tensão superficial e interfacial entre fases não miscíveis, possuindo assim, uma ampla gama de aplicações industriais e ambientais. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização do biossurfactante produzido pela linhagem bacteriana Ar70C7-2, isolada de amostras rochosas de um reservatório de petróleo offshore profundo localizado na Bacia de Campos (RJ). A estrutura química, propriedades tensoativas e ação antimicrobiana do biossurfactante foram estudadas para fins de aplicação na indústria do petróleo e de biocontrole microbiano. Essa linhagem, que apresentou 100% de similaridade com Bacillus alveayuensis, foi cultivada em Meio Mineral com glicerol e NH4NO3, contendo 70 g/L de NaCl, incubada a 55 °C e sem agitação para a produção de biossurfactante. O tensoativo produzido foi removido do meio através de precipitação ácida (HCl 6M), com rendimento de 0,27 g/L, seguido de extração com clorofórmio, semipurificação em coluna de sílica gel 60 e purificação no sistema Äkta Purifier acoplado a uma coluna C18. Suas propriedades tensoativas foram avaliadas indiretamente através de medidas do índice de emulsificação (E24) e diretamente pela tensão superficial e interfacial em tensiômetro automático, usando o método do anel de Du Nouy. Sua composição de aminoácidos foi determinada por HPLC, a quantificação de ácidos graxos por cromatografia gasosa e a estrutura química por espectroscopia de massas. O biossurfactante semipurificado (0,1%) apresentou E24 acima de 55%, tensão superficial de 31,8 mN/m, tensão interfacial (contra n-hexadecano) de 17,6 mN/m e concentração micelar crítica de 65 mg/L. Sua composição proteica foi de 7%, com cadeia de ácidos graxos variando de C14 a C18 e homólogo C16 como o mais abundante. A presença de cadeia de ácidos graxos juntamente a aminoácidos indica que o biossurfactante pertence à classe dos lipopeptídeos. Os espectros de massa indicam a presença de surfactina (m/z 1066, 1072, 1078 e 1081) e iturina (1066, 1072 e 1078), além de fengicinas (m/z 1331, 1354, 1410, 1424, 1434, 1452, 1495, 1553 e 1623). O biossurfactante semipurificado foi usado em testes de atividade antifúngica contra onze linhagens de fungos fitopatogênicos, onde foi observada completa inibição do crescimento das hifas em Moniliophthora perniciosa, Phytophthora sojae e Lasidiplodia euphorbicola e inibição parcial em Ceratocystis paradoxa, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizopus microsporus, Aspergillus flavus e Aspergillus niger. A atividade do tensoativo também foi testada contra as linhagens bacterianas Bacillus subtilis (ATTC 6633 e 21332), Staphylococcus epidermidis (ATTC 12228 e 35984), Pseudomonas fluorescens (ATTC 13525), Escherichia coli (ATTC 25922) e Desulfovibrio marinus BRS-1. Nos testes de microdiluição o biossurfactante causou uma inibição inicial pronunciada no crescimento de B. subtilis 6633, S. epidermidis (12228 e 35984), e moderada em P. fluorescens 13525. Sobre a bactéria redutora de sulfato D. marinus BRS-1 o biossurfactante mostrou ação bacteriostática e bactericida nas concentrações 2.250 e 2.500 μg/mL, respectivamente. O tensoativo semipurificado teve sua capacidade de recuperação de óleo em meio poroso avaliada pelo método de lavagem de areia, sendo capaz de remover, aproximadamente, 30% do óleo de motor (10W40) presente na amostra. O bissurfactante produzido pela linhagem estudada mostrou potencial aplicação em processos de MEOR e biorremediação de óleo, além de ser capaz de inibir o crescimento de fungos e bactérias, podendo ter utilidade com agente de biocontrole.Biosurfactants are amphiphilic microbial secondary metabolites capable of reducing the surface and interfacial tensions between two immiscible phases, characteristics that make them highly applicable in different industrial and environmental sectors. The goal of this work was to characterize the biosurfactant produced by bacterial strain Ar70C7-2, isolated from rock samples of a deep offshore oil reservoir located at Campos Basin (RJ). The chemical structure, surface-active properties and antimicrobial action of the biosurfactant were studied for application in the petroleum industry and microbial biocontrol. The strain showed 100% similarity with Bacillus alveayuensis and its biosurfactant was produced by growth in Mineral Medium with glycerol and NH4NO3, 70 g/L of NaCl and statically incubated at 55 °C. Crude biosurfactant obtained by acid precipitation (0.27 g/L yield) was extracted with chloroform followed by semi-purification on a silica gel 60 column and purification on a C18 column attached to an Äkta Purifier system. Surface-active properties was evaluated by measuring the emulsification index (E24) and surface/interfacial tension by a Du Nouy ring method on na automatic tensiometer. The amino acid profile was determined by HPLC, the quantification of fatty acids by gas chromatography and the chemical structure by mass spectroscopy. The semi-purified biosurfactant (0.1%) showed E24 above 55%, surface and interfacial tension of 31.8 and 17.6 mN/m with critical micelar concentration in 65 mg/L. The results indicated the presence of 7% of protein, fatty acid chains varying from C14 to C18 atoms, whith C16 homolog being the most abundant. The presence of fatty acid chains and amino acids indicates that the biosurfactant belongs to the class of lipopeptide. Mass spectra showed the presence of surfactin (m/z 1066, 1072, 1078 e 1081), iturin (1066, 1072 e 1078) and fengycin (m/z 1331, 1354, 1410, 1424, 1434, 1452, 1495, 1553 e 1623). Antifungal activity was determined against eleven different phytopathogenic fungal strains using biosurfactant semi-purified. Complete inhibition of hyphal growth was observed in cultures of Moniliophthora perniciosa, Phytophthora sojae and Lasidiplodia euphorbicola, and partial inhibition on Ceratocystis paradoxa, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizopus microsporus, Aspergillus flavus e Aspergillus niger. Antimicrobial activity was performed against the bacterial strains Bacillus subtilis (6633 e 21332), Staphylococcus epidermidis (12228 e 35984), Pseudomonas fluorescens (13525), Escherichia coli (25922) and Desulfovibrio marinus BRS-1. In microdilution tests, biosurfactant caused a pronounced inhibition in the initial growth of B. subtilis 6633, S. epidermidis (12228 and 35984), and moderate in P. fluorescens 13525. On the sulfate-reducing bacteria D. marinus BRS-1, concentrations of 2,250 and 2,500 μg/mL were shown to be bacteriostatic and bactericidal respectively . The biosurfactant had the oil recovery capacity evaluated by sand-washing method being able to remove aproximately 30% of oil present in the sample. Its surface-active properties associated with its good removal oil capacity suggest applicability in MEOR process and oil bioremediation, in addition to being able to inhibit the fungi and bacterial growth, and may have application as biocontrol agent