Structural and functional studies of glycoside hydrolases from thermophilic microorganisms

O esgotamento das reservas de petróleo, a crescente demanda energética de países emergentes e a necessidade de redução da emissão de dióxido de carbono sinalizam a importância pela busca de novas fontes de energias renováveis. Contudo, para que tais fontes tenham um caráter de efetiva substituição e não apenas de complementação, se fazem obrigatórias pesquisas por novas formas de se obtê-la. Assim, a produção do bioetanol mediante a hidrólise de biomassas lignocelulósicas, como do bagaço de cana-de-açúcar, por celulases tem recebido grande destaque. Devido ao seu potencial de evolução e redução de custos, a hidrólise enzimática da celulose pode ser uma peça fundamental para a produção de açúcares, etanol 2G e ácidos carboxílicos, com um custo competitivo a longo prazo. Alguns organismos termófilos, como as bactérias Clostridium thermocellum e Lactobacillus gasseri, o fungo Thermothielavioides terrestris e a bactéria mesófila Bacillus licheniformis, são exemplos conhecidos por sua capacidade em secretar celulases. C. thermocellum produz um complexo proteico multienzimático extracelular chamado celulossomo, que demonstra elevada capacidade de realizar uma eficiente degradação de biomassa celulósica, em especial na porção cristalina da celulose. A enzima CtBgl3B, -glicosidase (BGl) celulossomal de C. thermocellum da família de hidrolases de glicosídeos GH3, foi expressa em E. coli (BL21), purificada por cromatografia de afinidade e de separação por massa molecular. Apresentou características termofílicas, mostrando alta atividade em temperatura acima de 60 °C, variando o pH de 4,57,0, com maior atividade em pH 5,5 a 70 °C. Tm em 70 °C, determinada por fluorimetria diferencial de varredura (DSF) e dicroísmo circular (CD). Além disso, teve avaliada sua atividade enzimática e parâmetros cinéticos avaliados com pNPG: At. Esp. = 124 U mg1, KM = 0, 37 (mM), constante catalítica kcat = 173 (s1), e eficiência catalítica kcat/KM = 469 (mM1 s1). A enzima também demonstrou capacidade em atuar contra os substratos sintéticos como pNPX (40%) e CpNPG2 (25%). Enquanto no teste de aditivos, teve suas taxas de conversões aumentadas em média 70% na presença de Triton X-100, e 60% com Tween20. Por outro lado, apresentou queda significativa nas reações com a presença de íons divalentes, DMSO e SDS respectivamente abaixo de 25-75% da atividade relativa ao pNPG. A estrutura cristalográfica da CtBGl3 foi determinada por meio da difração de raios-X usando substituição molecular, com os limites de resolução anisotrópicos em Å nas respectivas direções 3,47 (a), 2,22 (b) e 1,78 (c). Demonstrando um arranjo dimérico, e com indicadores da qualidade do refinamento Rwork e Rfree, respectivamente 0,20 e 0,23. Experimentos de espalhamentos de luz em múltiplos ângulos (MALS) e espalhamento de raios-X a baixo ângulos (SAXS) corroboram que em solução CtBGl3 também adota arranjo dimérico. A bactéria mesofílica B. licheniformis produz uma proteína hipotética BlYlmD, que foi expressa em E. coli (Rosetta DE3) e teve sua estrutura determinada a 2,66 Å de resolução. Esse domínio proteico, cujo alinhamento indicava a presença de um domínio Cu-oxidase_4 (PF02578), também encontrado em lacases, e amplamente distribuído entre procariotos e eucarioto, ou de uma CNF1/YfiH-like cisteína hidrolase putativa de B. licheniformis BlYlmD, chamou a atenção devido suas semelhanças sequenciais com domínios de lacases, bem conhecidos, e se tornou o objeto de estudo nesta pesquisa. Sua estrutura é classificada como uma proteína / que forma quatro camadas de /// com folhas beta antiparalelas mistas e se reúne em um dímero na unidade assimétrica. Não teve sua função caracterizada para as funções sugeridas. Recentemente, foi comparada a uma purina nucleosídeo fosforilase PNP FAMIN multifuncional. Porém, também sem detecção de nenhuma atividade enzimática, sendo o principal indício estrutural da falta de atividade centrado na conformação da His47, e as diferenças entre os resíduos Tyr106 (Phe) e Glu77 (Asp), que podem afetar o volume da cavidade catalítica impedindo a entrada dos substratos.The depletion of petroleum reserves, the growing energy demand from emerging countries, and the need to reduce the emission of carbon dioxide signal the importance of searching for new sources of renewable energy. However, in order for such sources to have a character of effective replacement and not only complementation, it is also mandatory to search for new strategies to obtain it. Thus, the production of bioethanol through the hydrolysis of lignocellulosic biomass, such as sugarcane bagasse, by cellulases has received great attention. Due to its potential for evolution and cost reduction, the enzymatic hydrolysis of cellulose can be a fundamental part for the production of sugars, 2G ethanol and carboxylic acids, with a competitive cost in the long term. Some thermophilic organisms, such as the bacteria Clostridium thermocellum and Lactobacillus gasseri, the fungus Thermothielavioides terrestris and the mesophilic bacterium Bacillus licheniformis, are examples known for their ability to secrete cellulases. C. thermocellum produces an extracellular multienzymatic protein complex called cellulosome, which demonstrates a high capacity to perform an efficient degradation of cellulosic biomass, especially in the crystalline portion of cellulose. The enzyme CtBgl3B, -glycosidases (BGls) cellulosomal from C. thermocellum from the GH3 family of glycoside hydrolases, was expressed in E. coli (BL21), purified by affinity and size-exclusion chromatography. It showed thermophilic characteristics, showing high activity at temperatures above 60 °C, ranging from pH 4.5 to 7.0, with greater activity at pH 5.5 to 70 °C. Tm in 70 °C, determined by differential scanning fluorimetry (DSF) and circular dichroism (CD). In addition, its enzymatic activity and kinetic parameters were evaluated with pNPG: Sp. act. = 124 U mg1, KM = 0.37 (mM), catalytic constant kcat = 173 (s1), and catalytic efficiency kcat/KM = 469 (mM1 s1). The enzyme also demonstrated the ability to act against synthetic substrates such as pNPX (40%) and CpNPG2 (25%). While in the additive test, it had its conversion rates increased 70% in the presence of Triton X-100, and 60% with Tween20. On the other hand, it showed a significant decrease in the reactions with the presence of divalent ions, DMSO and SDS, respectively, below 25-75% its relative activity to pNPG. The crystallographic structure of CtBGl3 was determined employing X-ray diffraction using molecular replacement, with anisotropic resolution limits in Å along their respective directions 3.47 (a), 2.22 (b) e 1.78 (c), demonstrating a dimer arrangement, indicators of refinement quality Rwork and Rfree, respectively 0.20 and 0.23. Multi-angle light scattering (MALS) and small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments corroborate that in solution, CtBGl3 also adopts dimer arrangement. The mesophilic bacterium B. licheniformis produces a hypothetical protein BlYlmD, which was expressed in E. coli (Rosetta DE3) and had its structure determined at 2.66 Å resolution. This protein domain, whose alignment indicated the presence of a Cu-oxidase_4 domain (PF02578), also found in laccases, and widely distributed between prokaryotes and eukaryotes, or a putative CNF1/YfiH-like cysteine hydrolase from B. licheniformis BlYlmD, drew attention due to its sequential similarities with well-known laccase domains, and became the secondary object of study in this research. Its structure is classified as a / protein that forms four layers of /// with mixed antiparallel beta sheets and assembles into a dimer in the asymmetric unit. It did not have its function characterized for the suggested functions. It has recently been compared to a multifunctional purine nucleoside phosphorylase PNP FAMIN. However, also without detection of any enzymatic activity, the main structural indication for its lack of activity being centred on the conformation of His47, and the differences between the residues Tyr106 (Phe) and Glu77 (Asp), which can affect the volume of the catalytic cavity, preventing the entry of substrates