Production and characterization of virus-like particles (VLPs) of Zika virus produced in insect cells

As arboviroses se tornaram um grande problema de saúde pública nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. O vírus Zika (ZIKV) é uma doença causada por arbovírus, prevalente nas Américas, África e Ásia e tem aumentado sua área de endemicidade em todo o mundo. O diagnóstico da infecção é feito por meio de técnicas moleculares e testes sorológicos. Devido aos avanços das infecções causadas pelo ZIKV, é de extrema importância o desenvolvimento de ferramentas que permitam seu combate adequado. As vacinas de partículas semelhantes a vírus (VLPs) apresentam-se com enorme potencial de uso como vacinas antivirais extremamente eficazes, pois mimetizam a partícula viral, induzindo resposta imune e, por não possuírem o material genético do vírus, não se replicam no organismo, tornando-as seguras como vacinas. Neste trabalho, nós estabelecemos uma metodologia para produção e caracterização de VLPs contendo as proteínas estruturais, C, prM e E, do ZIKV produzidas em células de inseto utilizando o sistema de expressão gênica derivado de baculovírus. Para isso, foi construído o vetor pFast-E-ZIKV contendo as sequências gênicas das proteínas de interesse do ZIKV e este foi utilizado para gerar os bacmídeos recombinantes (Bac-E-ZIKV) através da transformação em células DH10BacTM . O Bac-E-ZIKV gerado foi transfectado em células de inseto Spodoptera frugiperda (Sf9) e lotes de baculovírus recombinantes (BV-E-ZIKV) foram obtidos para ensaios de infecção. Os ensaios de infecção foram realizados com uma multiplicidade de infecção viral (MOI) de 2 do BV-E-ZIKV. As células Sf9 foram infectadas e o sobrenadante foi coletado 96h pós-infecção. A expressão da proteína E-ZIKV na superfície das células pode ser observada por ensaios de imunofluorescência indireta e western blot. Para concentrar e purificar as VLPs produzidas do BV-E-ZIKV testamos os gradientes de sacarose e iodixanol e pudemos avaliar a expressão das proteínas E-ZIKV pelo ensaios de dot blot e western blot. As VLPs foram analisadas e caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e pudemos observar estruturas esféricas semelhantes ao ZIKV nativo de 50 a 65 nm contendo as proteínas E-ZIKV em sua superfície. Os resultados obtidos neste projeto podem gerar ferramentas importantes no desenvolvimento de um método de vacina contra o ZIKV.Arboviruses have become a public health problem in the tropical and subtropical regions of the world. The Zika virus (ZIKV) is an arboviral disease prevalent in the Americas, Africa and Asia and has increased its area of endemicity around the world. The diagnosis of the infection is made through molecular techniques and serological tests. Due to the advances of the infections caused by the ZIKV it is of extreme importance the development of tools that allow the adequate combat of the ZIKV. Virus-like particles (VLPs) vaccines appear as an enormous potential for use as extremely effective antiviral vaccines, since they mimic the viral particle, inducing immune response and, as they dont have the genetic material of the virus they wont replicate in the organism, making them safe as viral particles. In this work, we established a methodology for production and characterization of VLPs containing the structural proteins, C, prM and E, of ZIKV produced in insect cells using the gene expression system derived from baculovirus. For this, the vector pFast-E-ZIKV was constructed containing the gene sequences of the proteins of interest of the ZIKV and it was used to generate the recombinant bacmids (Bac-E-ZIKV) through transformation into DH10BacTM cells. The generated Bac-E-ZIKV was transfected in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells and batches of recombinant baculovirus (BV-E-ZIKV) were obtained for the infection assays. Infection assays were performed with a multiplicity of infection (MOI) of 2 from BV-E-ZIKV. The Sf9 cells were infected and the supernatant was collected 96h post-infection. The expression of the E-ZIKV protein on the cell surface could be observed by indirect immunofluorescence and western blot assays. To concentrate and purify the VLPs produced from BV-E-ZIKV we tested the sucrose and iodixanol gradients and we were able to evaluate the expression of E-ZIKV protein by dot blot and western blot assay. The VLPs were analyzed and characterized by transmission electron microscopy and we were able to observe spherical structures similar to the native ZIKV from 50 to 65 nm containing the E-ZIKV proteins on their surface. The results obtained in this project can generate important tools in the development of a vaccine method against ZIKV