Funcionalização de nano-lipossomas para entrega de toxinas marinhas como agentes anticancerígenos

Dissertação de mestrado em Biofísica e BionanossistemasEvery year a high number of cancer patients are recorded. Chemotherapy is one of the most common treatments in the clinic and is based on the use of drugs with anticancer properties, at high concentrations and mostly without any particular targeting to cancer cells. In the last decade there have been significant developments on nanoparticles for more effective drug delivery, which allows not only to improve the drug’s biodistribution, but also to target its release into cancer cells, by functionalization of these nanovehicles. In this way, it is possible to decrease the concentration required to attain the desired effect and consequently the side effects related to chemotherapy. Accordingly, this work is based on the functionalization of nanoliposomes, sensitive to pH and loaded with yessotoxin, a marine toxin derived from microalgae with anticancer properties. A functionalization protocol developed for the nanoliposomes was established by binding the ligand SDF-1α, which is specific for chemokine receptor CXCR4, overexpressed in more than twenty different cancer cell lines. Thus, the developed functionalized nanoliposomes, either empty or carrying the bioactive agent, were characterized by dynamic and electrophoretic light scattering, and transmission electron cryomicroscopy. In addition, their stability and production reproducibility were verified, as well as release profile. Tracking of nanoliposomes labeled with a fluorescent probe was further screened in vivo. Action efficiency of the developed functionalized nanosystem was tested in vitro in human normal epithelial cells (HK-2) and prostate and breast cancer cell lines (PC-3 and MCF- 7, respectively), which have different levels of expression of the CXCR4 receptor. The functionalized nanoliposomes demonstrated significant cytotoxicity targeted to cancer cells, while not affecting normal cells, as opposed to the free toxin. The nanosystem performance was also evaluated in vitro, in cells exposed to different physiological pHs, among which that simulating the endosomal microenvironment.Todos os anos é reportado um elevado número de casos de cancro. A quimioterapia é um dos tratamentos tradicionais mais usados atualmente, fazendo uso de fármacos com propriedades anticancerígenas em elevadas concentrações, maioritariamente sem um direcionamento específico e controlado para células cancerígenas. Na última década houve avanços significativos no desenvolvimento de nanopartículas para entrega mais eficaz de fármacos, dado que permitem não só melhorar a sua biodistribuição, mas também direcionar com elevada especificidade as nanopartículas que os transportam para células cancerígenas, por aplicação de protocolos de funcionalização. Desta forma é possível diminuir a concentração necessária para o efeito desejado, e consequentemente, os efeitos secundários relativos à quimioterapia. Neste contexto, este trabalho visa a funcionalização de nanolipossomas, sensíveis a modificações de pH, e carregados com iesotoxina, uma toxina marinha derivada de microalgas com propriedades anticancerígenas. O protocolo de funcionalização desenvolvido para os nanolipossomas ocorre por via do ligando SDF-1α, o qual é específico para o recetor CXCR4, sobreexpresso em mais de vinte tipos celulares de cancro. Os nanolipossomas funcionalizados, vazios ou carregando o agente bioactivo, foram caracterizados por espalhamento de luz dinâmico e eletroforético, e por criomicroscopia eletrónica de transmissão. Adicionalmente, a sua estabilidade e reproducibilidade foi verificada, bem como o seu perfil de libertação da carga encapsulada. Foi ainda realizado o rastreamento de nanolipossomas marcados com uma sonda fluorescente in vivo. A eficiência de ação do nanossistema funcionalizado foi testada in vitro em células humanas do epitélio normal (HK-2) e em linhas celulares cancerígenas de próstata e mama (PC-3 e MCF-7, respetivamente), com diferentes níveis de expressão do recetor CXCR4. Os nanolipossomas funcionalizados demonstraram uma citotoxicidade significativa direcionada para células cancerígenas, não afetando, contudo, células normais, ao contrario da toxina livre. Foi ainda avaliada in vitro a internalização do nanossistema por células expostas a diferentes pHs fisiológicos, entre os quais o pH simulando o microambiente endossomal