Investigation de l'équilibre transglycosylation/hydrolyse chez les glycoside hydrolases agissant avec rétention de configuration

Carbohydrate synthesis is important for a number of areas, including the development of diagnostics and chemotherapeutics. However, glycochemistry is challenging especially when furanose-based motifs are targeted. Indeed, furanosides figure prominently among the most difficult carbohydrates to synthesize. Nevertheless, they are of interest, because they are important components of many biopolymers and are present in many pathogenic microorganisms. For this reason, it is pertinent to study furanoside hydrolases as potential glycosynthetic tools. In pursuit of this goal, the family GH51 α-L-arabinofuranosidase from Thermobacillus xylanilyticus (TxAbf) has been extensively studied and engineered to create efficient transfuranosylases. Herein, work on TxAbf is pursued, focusing on four aspects: (i) A structure-function study was used to probe two subsite -1 determinants. Study of F26L and L352M revealed that residue L352 intervenes in both subsites -1 and +1, whereas F26 is limited to subsite -1. Moreover, the triple mutant R69H-N216W-L352M causes a domino-like effect, increasing local flexibility, thus creating new interactions with acceptor molecules. (ii) Studying self-condensation using mutagenesis afforded increased overall yields of homo-oligofuranosides. Significantly, the substitution N216W in TxAbf engenders an additional binding subsite that drives altered regioselectivity. (iii) Focusing on the synthesis of D-galactofuranosides, mutant R69H-N216W proved to be a tool of choice for transgalactofuranosylation. However, further mutagenesis afforded higher regioselectivity towards (1,3)-linkages. Likewise, the synthesis of ẞ-D-Galf-(1,3)-α-D-Glcp and Galf-(1,n)-α-D-GlcpNAc are reported. (iv) Working within a wide consortium of research teams, it has been possible to demonstrate the usefulness and genericity of a simple protein engineering strategy that can be used to rapidly design potent transglycosylases, starting from retaining glycoside hydrolases.La synthèse de sucres est importante et pertinente, car applicable au développement de diagnostics et de molécules thérapeutiques. Cependant, la glycochimie reste laborieuse, en particulier pour la synthèse de furanosides, ce type de synthèse figurant parmi les plus difficiles à réaliser. Néanmoins, les furanosides sont d’intérêt, étant présents dans de nombreux biopolymères et chez certains microorganismes pathogènes. Ainsi il est pertinent d’étudier les furanoside hydrolases en tant qu’outils glycosynthétiques potentiels. Dans ce cadre, l’α-L-arabinofuranosidase de Thermobacillus xylanilyticus (TxAbf) de la famille GH51 a été étudiée et modifiée pour créer des transfuranosylases efficaces. Ici, poursuivant nos études de TxAbf, quatre aspects sont abordés : (i) Une étude structure-fonction porte sur deux déterminants du sous-sites -1. Cette étude révèle que le résidu L352 intervient dans les deux sous-sites -1 et +1, tandis que l’action de F26 reste limitée au sous-site -1. De plus, le triple mutant R69H-N214W-L352M provoque un effet domino, augmentant la flexibilité locale, créant ainsi de nouvelles interactions avec les molécules acceptrices. (ii) L’étude de l’autocondensation a permis d’augmenter les rendements globaux en homo-oligofuranosides. Fait significatif, la substitution N216W dans TxAbf génère un sous-site de liaison supplémentaire et une modification de regiosélectivité. (iii) Concernant la synthèse de D-galactofuranosides, le mutant R69H-N216W s’avère être un outil de choix. Toutefois, sa regiosélectivité vers des liens (1,3) peut être augmenté par l’introduction d’autres mutations. La synthèse de D-Galf-(1,3)-α-D-Glcp et de ß-D-Galf-(1,n)-α-D-GlcpNAc sont également décrites. (iv) Travaillant avec d’autres équipes de recherche, il a été possible de démontrer l’utilité et la généricité d’une stratégie d’ingénierie des protéines simple permettant de rapidement concevoir de puissantes transglycosylases, à partir de glycoside hydrolases agissant par rétention