Mécanisme d’action de la stratégie d’immunothérapie locale TLR9L+aIL- 10Rα contre les carcinomes épidermoïdes cutanés

Skin carcinomas represent 90% of skin cancers. Current treatment strategies, surgery and radiotherapy are not very effective against invasive forms. The initiation of treatment involving a long-term immune response would make it possible to control these invasive forms and their recurrence. The team has thus developed an immunotherapy based on the peritumoral injection of a TLR9 agonist (ODN2395) with an antibody blocking signaling through the IL-10 receptor (CD210). This therapeutic strategy induces the total regression of established skin tumors of size between 50 and 130 mm3 but does not allow the control of larger tumors in mice. Sometimes tumor regression is partial and associated with fibrosis, which appears to serve as a substrate for tumor progression. The objective of my thesis was to understand the cellular and molecular mechanisms of this local immunotherapy strategy in order to optimize it. In the murine model of TC-1 cutaneous carcinoma, we first identified a key role of dendritic cells (DC) in the response to treatment. Analysis of the dynamics of DCs by flow cytometry suggests their migration into tumor-draining lymph nodes, associated with the expression of maturation markers such as CD80, CD86, PD-L1 and PD-L2. Using an ex vivo approach, we have demonstrated the increased antigenic presentation capacities of DCs, in particular cDC2, capable of educating effector CD8 T lymphocytes, producers of INF-, TNF and IL-17, which are protective against recurrence. We have also identified a prominent role of innate immunity cells in tumor regression associated with diffuse hemorrhagic necrosis in the early hours after treatment injection. Analysis of immune cells infiltrating tumors by flow cytometry reveals the majority presence of heterogeneous macrophages in untreated tumors which are activated locally 12 hours after local immunotherapy. The injection of immunotherapy induces a total rearrangement of the immune infiltrate within the first 72 hours, associated with a massive recruitment of activated neutrophils (CD62LlowICAM-1bright) and cytotoxic: producers of reactive oxygen species (ROS) , myeloperoxidase (MPO) or even Granzyme B. Their depletion in vivo by the injection of depleting anti-Ly6G antibodies considerably impacts the response to treatment, which demonstrates their essential role in tumor regression The study of the mechanism of recruitment of anti-tumor neutrophils to the tumor site highlights the role of chemokines CXCL1 and CXCL2 produced by macrophages and the involvement of CXCR1 and CXCR2 receptors. All of my thesis work reveals the mechanism of action of the TLR9L+aIL-10R local immunotherapy strategy in the murine model of TC-1 skin tumors involving the establishment of a complementary adaptive and innate immunity. Ultimately, the development of an immunomodulatory treatment in humans, based on our formulation, constitutes an interesting therapeutic approach for the treatment of invasive cutaneous squamous cell carcinomas.Les carcinomes cutanés représentent 90% des cancers de la peau. Les stratégies actuelles de traitement, la chirurgie et la radiothérapie sont peu efficaces contre les formes invasives. La mise en place d’un traitement impliquant une réponse immunitaire à long terme permettrait de contrôler ces formes invasives et leurs récidives. L’équipe a ainsi développé une immunothérapie basée sur l’injection péri-tumorale d’un agoniste de TLR9 (ODN2395) avec un anticorps bloquant la signalisation à travers le récepteur à l’IL-10 (CD210). Cette stratégie thérapeutique induit la régression totale des tumeurs cutanées établies de taille comprise entre 50 et 130 mm3 mais ne permet pas le contrôle de tumeurs plus grosses chez la souris. Parfois, la régression tumorale est partielle et associée à une fibrose, qui semble servir de substrat à la progression tumorale. L’objectif de ma thèse était de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette stratégie d’immunothérapie locale afin de l’optimiser. Dans le modèle murin de carcinomes cutanés TC-1, nous avons d’abord identifié un rôle clé des cellules dendritiques (DC) dans la réponse au traitement. L’analyse de la dynamique des DC par cytométrie de flux, suggère une migration de ces-dernières dans les ganglions drainant la tumeur, associée à l’expression de marqueurs de maturation tels que CD80, CD86, PD-L1 et PD-L2. Par une approche ex vivo nous avons mis en évidence les capacités de présentation antigénique accrues des DC, notamment les cDC2, capables d’éduquer les lymphocytes T CD8 effecteurs, producteurs d’INF-, de TNF et d’IL-17, protecteurs contre les récidives. Nous avons également identifié un rôle prépondérant des cellules de l’immunité innée dans la régression tumorale associée à une nécrose hémorragique diffuse dans les heures précoces suivant l’injection du traitement. L’analyse des cellules immunitaires infiltrant les tumeurs par cytométrie de flux, révèle la présence majoritaire de macrophages hétérogènes dans les tumeurs non traitées qui s’activent localement 12 heures après immunothérapie locale.L’injection de l’immunothérapie induit un remaniement total de l’infiltrat immunitaire dans les 72 premières heures, associé à un recrutement massif de neutrophiles activés (CD62LlowICAM-1bright) et cytotoxiques : producteurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), de myélopéroxydase (MPO) ou encore de Granzyme B. Leur déplétion in vivo par l’injection d’anticorps déplétants anti-Ly6G, impacte considérablement la réponse au traitement ce qui démontre leur rôle primordial dans la régression tumorale L’étude du mécanisme de recrutement des neutrophiles anti-tumoraux sur le site tumoral met en évidence le rôle des chimiokines CXCL1 et CXCL2 produites par les macrophages et l’implication des récepteurs CXCR1 et CXCR2. L’ensemble de mes travaux de thèse révèle le mécanisme d’action de la stratégie d’immunothérapie locale TLR9L+aIL-10R dans le modèle murin de tumeurs cutanées TC-1 impliquant la mise en place d’une immunité adaptative et innée complémentaires. A terme, le développement d’un traitement immunomodulateur chez l’Homme, basé sur notre formulation, constitue une approche thérapeutique intéressante pour le traitement des carcinomes épidermoïdes cutanés invasifs