Garder la distance au sein du génome : le rôle de Sen1 et des RNases H

Intrinsic damage potential from transcription originates from different sources, among which Transcription-Replication Conflicts (TRCs). The transcription process is tightly regulated, both at the level of initiation and termination to avoid risks of conflict with other DNA- associated processes. Nevertheless, many transcription events occur in the genome that are seemingly non-functional, which defines the concept of pervasive transcription and underscores the challenging necessity for the cell to coordinate transcription with other processes. TRCs take place upon encountering of the transcription and the replication machineries, and can lead to replication fork stalling and potentially DNA damage. TRCs are linked to the formation of R-loops, which are intermediate heteroduplexes formed when the nascent RNA hybridizes to its own DNA template in the wake of the polymerase, thus extruding a single stranded DNA molecule. R-loops have both physiological functions as intermediates of some cellular processes, and a genotoxic effect when their formation is unscheduled. Moreover, they are an impediment to the progression of replicative forks, being able by themselves to induce fork stalling. The evolutionary conserved helicase Sen1 (SETX in human) plays a prominent role in limiting and resolving TRCs. On the one hand, as component of the Nrd1-Nab3-Sen1 (NNS) complex, Sen1 is an essential transcription termination factor, responsible for dislodging the transcriptional apparatus from thousands of non-coding genes (i.e., Cryptic Unstable Transcripts or CUTs). On the other hand, Sen1 has been proposed to prevent R-loops accumulation by virtue of its DNA:RNA unwinding activity. Currently, the specific mechanisms by which Sen1 affects R-loops levels and/or TRCs is unknown, and previous works have been performed with sen1 mutants that strongly also affect its transcription termination function. Here, we focused on the dissection of the role of Sen1 in genome stability, aiming at separating the functions of Sen1 in non-coding RNA genes termination and at R-loops and/or TRCs. In the frame of a collaborative work, we have shown that Sen1 interacts directly with the replisome and participated in characterizing a mutant (sen1-3) that harbours three point mutations that completely abolish binding of Sen1 to the replisome, yet leaving untouched its ability to terminate transcription via the NNS pathway. Importantly, RNase H activity, brought by either one of the two yeast RNase H enzymes, is essential in sen1-3 cells, thus suggesting that Sen1 plays a role at the replisome that might be redundant or concurrent with the one of RNases H. These are ribonucleases that have been shown to have a critical function in R-loops clearance, thanks to their ability to recognize and digest DNA:RNA hybrids. By a systematic and comprehensive genomic approach, we investigated the role of Sen1 and its link with RNases H, unveiling that Sen1 promotes removal of RNA polymerase II at many locations where conflicts with replication or other processes occur. We have also studied the role of RNases H in these processes and the impact of R-loops. To this end we have developed a novel method, H-CRAC, to detect RNase H targets, possibly R-loops, with nucleotide resolution. We show that H-CRAC signals significantly overlap available lower resolution R-loops maps and provide evidence that at least a fraction of R-loops can be detected by this method. We propose a model that integrates the roles of RNases H and Sen1 in the resolution of replication- and transcription-transcription conflicts.Le potentiel de dommages liés intrinsèquement à la transcription provient de différentes sources, parmi lesquelles les conflits entre transcription et réplication (CTR). Le processus de transcription est étroitement régulé, tant au niveau de l'initiation que de la terminaison, afin d'éviter les risques associés aux conflits avec d'autres processus liés à l'ADN. Néanmoins, de nombreux événements de transcription se produisent dans le génome alors qu'ils sont apparemment non fonctionnels, ce qui définit le concept de transcription omniprésente et souligne la nécessité pour la cellule de coordonner la transcription avec d'autres processus. Les CTR se produisent lors de la rencontre entre les machineries de transcription et de réplication, entraînant un blocage de la fourche de réplication et provoquant potentiellement des dommages à l'ADN. Les CTR sont liés à la formation de R-loops, qui sont des hétéroduplexes intermédiaires formés lorsque l'ARN naissant s'hybride à sa propre matrice d'ADN, extrudant ainsi une molécule d'ADN simple brin. Les R-loops ont à la fois des fonctions physiologiques en tant qu'intermédiaires de certains processus cellulaires et un effet génotoxique lorsque leur formation n'est pas programmée. De plus, ils sont un obstacle à la progression des fourches réplicatives, étant capables par eux-mêmes d'induire un blocage de la fourche. L'hélicase Sen1 (SETX chez l'homme), conservée au cours de l'évolution, joue un rôle important dans la limitation et la résolution des CTR. D'une part, en tant que composant du complexe Nrd1-Nab3-Sen1, Sen1 est un facteur essentiel de terminaison de la transcription, fonctionnant sur de milliers de gènes non codants (c'est-à-dire des transcrits cryptiques instables ou CUTs). D'autre part, il a été proposé que Sen1 empêche l'accumulation de R-loops en vertu de son activité de déroulement de l'ADN:ARN. Actuellement, les mécanismes spécifiques par lesquels Sen1 affecte les niveaux de R-loops et des CTR ne sont pas bien définis, et la plupart des expériences précédentes ont été réalisées avec des mutants de Sen1 qui affectent fortement aussi sa fonction de terminaison de la transcription. Notre travail porte sur la dissection du rôle de Sen1 dans la stabilité du génome, visant à séparer les fonctions de Sen1 dans la terminaison des gènes d'ARN non codant et au niveau des R-loops et des CTR. Dans le cadre d'un travail collaboratif, nous avons montré que Sen1 interagit directement avec le replisome et avons caractérisé un mutant (sen1-3) qui porte trois mutations ponctuelles qui abolissent la liaison de Sen1 au replisome, tout en laissant intacte sa capacité à terminer la transcription via la voie NNS. Il est important de noter que l'activité RNase H, apportée par l'une ou l'autre des deux enzymes RNase H de levure, est essentielle dans les cellules sen1-3, ce qui suggère que Sen1 joue un rôle au niveau du replisome qui pourrait être redondant ou concurrent à celui des RNases H. Ces facteurs sont des ribonucléases qui ont une fonction critique dans l'élimination des R-loops, grâce à leur capacité à reconnaître et à digérer les hybrides ADN:ARN. Par une approche génomique systématique, nous avons étudié le rôle de Sen1 et son lien avec les RNases H, révélant que Sen1 favorise l'élimination de l'ARN polymérase II à de nombreux endroits où se produisent des conflits avec la réplication ou d'autres processus. Nous avons également étudié le rôle des RNases H dans ces processus et l'impact des R-loops. A cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode, H-CRAC, pour détecter les cibles RNaseH avec une résolution nucléotidique. Nous montrons que les signaux H-CRAC chevauchent de manière significative les cartes R-loop connues de résolution plus faible et nous apportons la preuve qu'au moins une fraction des R-loops peut être détectée par cette méthode. Nous proposons un modèle qui intègre les rôles des RNases H et Sen1 dans la résolution des CTR et sur d'autres sites de conflits