EFFETTO DI PALMITOILETANOLAMIDE ULTRAMICRONIZZATA (PEA-UM) SULLA DEGRANULAZIONE MASTOCITARIA IN UN MODELLO EX VIVO DI CUTE DI CANE

Scopo del lavoro - L’allestimento di colture di organo di cute rappresenta un modello innovativo per la ricerca dermatologica veterinaria. Il suo utilizzo - finora limitato al settore umano o degli animali da laboratorio (Lu et al., 2007; Kondo et al., 1990) - consente infatti di studiare il comportamento cellulare, mantenendo la complessità e l’organizzazione dell’ambiente naturale. I mastociti (MC) sono cellule immuno-infiammatorie, residenti nei tessuti di frontiera, che svolgono un ruolo sentinella nelle superfici cutanee e mucosali, interagendo con un complesso milieu di segnali locali e sistemici. Poterne studiare l’attività, mantenendo le caratteristiche “3D” del tessuto, è pertanto un grande vantaggio. In un recente studio clinico multicentrico, la somministrazione di palmitoiletanolamide in forma ultramicronizzata (PEA-um) si è dimostrata clinicamente efficace in cani con dermatite atopica (DA) (Noli et al., 2015) ed aumentati livelli endogeni di PEA nella cute di cani con DA sono stati documentati da Campora et al. (2012). Questi risultati rendono la PEA un composto di estremo interesse nel campo delle patologie dermatologiche su base allergica. Nel presente studio, si documentano gli effetti di PEA-um sulla degranulazione dei MC indotta dal composto 48/80, in un modello ex vivo di coltura di organo di cute di cane. Materiali e metodi - Espianti di cute sono stati ottenuti da 6 cani di proprietà, sottoposti ad intervento chirurgico di mastectomia, previo consenso scritto da parte dei proprietari. I lembi cutanei, prelevati da aree non interessate da processi patologici, sono stati immediatamente immersi in mezzo di trasporto (99% Williams’ E Medium-L-glutamin free con 1% di soluzione contenente 10000 IU di penicillina, 10 mg streptomicina and 25 μg di amfotericina B per mL). Da ogni lembo di cute sono state ottenute biopsie a tutto spessore. Tre biopsie per esperimento sono state fissate in formalina tamponata al 10% prima di ogni trattamento (G0). Le altre biopsie sono state messe in coltura in piastre petri contenenti Williams’ E medium con 1% 10000 IU/ml penicillina-10 mg/ml streptomicina, 0,1% 10 μg/ml insulina, 0,02% 10 ng/ml idrocortisone e 1% 200mM L-glutamina. Le colture sono state mantenute a 37 °C in umidificatore a 5% CO2 con cambio del mezzo a giorni alterni. Un set di triplicati è stato trattato con composto 48/80 a 10 μg/ml per 72h in presenza o assenza di PEA-um 30μM. Alla fine del trattamento, i campioni sono stati fissati in formalina tamponata al 10% e processati routinariamente, ed è stato valutato il numero di MC/mm2 (su tutta l’area della biopsia) e di MC degranulati/mm2 (con più di 6-7 granuli extracellulari vicino alla membrana). Un secondo set di triplicati è stato utilizzato per valutare eventuali effetti avversi di PEA-um (10 e 30μM) per 4 giorni di trattamento (G1-G5). Dopo processazione, sono state analizzate le condizioni morfologiche generali ed è stato misurato lo spessoredell’epidermide. I dati sono stati analizzati tramite analisi della varianza e test di Tukey per i confronti multipli. Risultati - Il numero di MC totali per mm2 (5,61 ± 2.33) non ha dimostrato variazioni statisticamente significative nei diversi gruppi di trattamento. L’applicazione del composto 48/80 ha provocato un aumento statisticamente significativo della degranulazione dei MC (p<0,01), efficacemente contrastato dal trattamento con PEA-um (p<0,01). Le condizioni morfologiche generali della cute e lo spessore dell’epidermide dopo trattamento con PEA-um non apparivano diverse da quelle osservate nei campioni trattati con solo veicolo. Nell’epidermide si osservava una normale stratificazione: cheratinociti basali, squamosi, cellule appiattite con sparsi granuli cheratoialini e corneociti. Conclusioni - Il numero totale di MC per mm2 è inferiore rispetto a quanto pubblicato in un precedente studio (Auxilia et al., 2000), dove, però, l’osservazione era limitata all’area subepidermica. Il modello utilizzato ha consentito di dimostrare sia l’effetto degranulante del composto 48/80 sia l’effetto modulante di PEA-um sulla risposta dei MC cutanei, il cosiddetto effetto ALIA (Re et al., 2007). Il trattamento con PEA-um non ha dimostrato cambiamenti avversi in questo studio preliminare. Metodologie analitiche più approfondite sono necessarie al fine di valutare gli effetti di PEA-um sull’omeostasi generale della cute e, più in particolare, su stimoli degranulanti di maggiore rilevanza fisiopatologica