NMR študije G-kvadrupleksov v regulatornih motivih RNA udeleženih v vnetnih procesih

Transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) is a protein of great importance for the development of virus-induced COVID-19 disease. Large number of TMPRSS2 are expressed on the surface of human respiratory tract epithelial cells. It was proven that by catalytic cleavage of the S protein of the SARS-CoV-2 virus this enzyme enables viral activation for the fusion of the virion with cellular membrane, i.e., the entry of the virus into the human cell. Therefore, inhibition of TMPRSS2 could be used as the tool for the management of SARS-CoV-2 infection. It is known that the formation of secondary structures in the 5\u27-UTR region of mRNA can inhibit protein translation. Particularly important motifs that affect translation are G-quadruplexes (G4). G4s are tetrahelical structures formed by sequences rich in guanine residues, which are arranged in G-tracts separated by short (up to seven residues) stretches of random nucleotides. G-rich region is present in the 5\u27- UTR region of TMPRSS2. Using various analytical techniques, primarily high-resolution nuclear magnetic resonance, we confirmed that G-rich sequence from the 5\u27-UTR region of TMPRSS2 mRNA could form a family of G4 structures in the presence of potassium ions at conditions close to physiological (pH 7, T of 40°C). Using mutational analysis, we showed that G4s of parallel topology are formed, which have high thermal stability (Tm is about 70°C). We performed a detailed NMR study of G4 formed by mutated oligonucleotide corresponding to one of folds present in the wild type ensemble. We also investigated the complex of selected G4 with PhenDC3 ligand. We observed changes in NMR spectra which confirmed binding of PhenDC3 to outer G-quartets without changing topology. According to literature data TMPRSS2 could be inhibited without decreasing epithelial cell viability. Therefore, stabilization of G4 in 5\u27-UTR region of mRNA which could affect protein translation could be considered as potential approach for the development of treatment for COVID-19 disease.Tvorba sekundarnih struktur v 5\u27-UTR regijah mRNA vpliva na njihovo prevajanje in posledično, na koncentracijo proteinov v celicah. G-kvadrupleksi so štirivijačne sekundarne strukture RNA, ki lahko nastanejo v UTR regiji, kar vpliva na prevajanje. G-kvadruplekse tvorijo zaporedja, ki so bogata z gvaninskimi ostanki. Več zaporednih gvaninskih ostankov v oligonukleotidu imenujemo G-trakti, le ti pa so ločeni z negvaninskimi ostanki. Prisotni morajo biti vsaj štirje G-trakti, ki se med seboj povežejo z nekanoničnimi Hoogsteenovimi vodikovimi vezmi in tako tvorijo planarne motive, G-kvartete. Le ti se nalagajo drug na drugega in tvorijo G-kvadruplekse. Med G-kvartete so koordinirani kalijevi ioni, ki stabilizirajo G-kvadruplekse. Negvaninski ostanki, ki povezujejo gvaninske ostanke v G-kvartetih, tvorijo zanke v G-kvadrupleksih. Optimalno dolge zanke vsebujejo enega do sedem (1-7) ostankov. Predolge zanke praviloma destabilizirajo G-kvadruplekse zaradi pozitivne entropije. G-kvadrupleksi tako predstavljajo sterično oviro, saj preprečijo drsenje ribosomalnega kompleksa vzdolž verige mRNA ter na ta način ovirajo translacijo. V 5\u27-UTR regiji mRNA transmembranske serinske proteaze 2 (TMPRSS2) smo opazili z gvanini bogato zaporedje, ki ima potencial za tvorbo G-kvadrupleksov. TMPRSS2 receptor je intenzivno preučevan pri bolnikih z rakom prostate, saj so v obolelih celicah opazili spremembe v genu, ki vsebuje zapis za omenjen receptor. Med COVID-19 pandemijo se je zanimanje za TMPRSS2 receptor povečalo, saj ima tudi ključno vlogo pri vstopu SARS-COV-2 virusa povzročevalca COVID-19 v človeške celice. TMPRSS2 je v veliki meri izražen na površini človeških epitelijskih celic dihalnih poti. Potrjeno je, da ta encim s katalitskim cepljenjem S proteina virusa SARS-CoV-2 omogoča njegovo aktivacijo za fuzijo viriona s celično membrano, ter tako povzroči vstop virusa v človeško celico in okužbo. Zato predvidevajo, da s preprečevanjem izražanja receptorjev TMPRSS2 na površini človeških epitelijskih celic lahko preprečimo vstop virusa v celico. Iz 5\u27-UTR dela nukleotidnega zaporedja mRNA, ki nosi zapis za protein TMPRSS2, ki ga vsebuje spletna baza podatkov (NCBI), smo izbrali 27 nukleotidov dolg z gvanini bogat fragment, ki se nahaja med 14. in 41. nukleotidom v zaporedju. Ta fragment vsebuje tri G-trakte, sestavljene iz štirih gvaninskih ostankov in enega, ki vsebuje tri gvaninske ostanke. Med gvaninskimi trakti so negvaninski deli, dolgi 1-3 nukleotide, ki so primerni za tvorbo zank v nastalem G-kvadrupleksu. Izbrani oligonukleotid in variante z mutacijami smo sintetizirali na avtomatskem sintetizatorju in z različnimi analitskimi tehnikami ugotovili, da dejansko tvori več G-kvadrupleksov v prisotnosti kalijevih ionov pri pogojih podobnih fiziološkim (pH 7, T 40 °C). Glavna analizna tehnika, uporabljena v tej raziskavi, je jedrska magnetna resonanca (NMR). NMR je močno orodje za določanje prostorske razporeditve biomolekul, saj zagotavlja podatke o razdalji med atomi, ne glede na to, ali so povezani s kovalentnimi vezmi ali pa so le blizu drug drugemu. Iz 1D 1H spektra nativnega oligonukleotida smo takoj opazili nastanek G-kvadrupleksnih struktur. O tem smo zaključili, ker so bili v spektru vidni signali v imino regiji (9-11,5 ppm), ki pripadajo protonom, vezanim na imino-dušik purinske baze gvanina, preko katerih se tvorijo vodikove vezi pri Hoogsteenovi povezavi gvaninskih ostankov v G-kvartet. Vendar so bili signali v spektru široki in slabo ločeni, kar je posledica prisotnosti velikega števila struktur. Zaradi G-traktov neenake dolžine nastane veliko različnih izomerov, ki se nahajajo v izmenjavi med sabo (G-registrska izmenjava). Ta pojav pomeni vertikalno drsenje G-traktov enega glede na drugega, kar določa, kateri gvaninski ostanek bo sodeloval pri tvorbi kvadrupleksa. Omejevalni G-trakt v izbranem zaporedju ima tri gvaninske enote, tako da G-kvadrupleks lahko tvori le tri G-kvartete. To pomeni, da bo en zunanji gvanin v preostalih treh G-traktih izven jedra G-kvadrupleska. Zaradi prisotnosti večjega števila struktur nativno zaporedje ni bilo primerno za bolj podrobno NMR študijo. Zato smo za nadaljnje raziskave "zaklenili" posamezne strukture prisotne v ansamblu, ki ga tvori nativno zaporedje. Oligonukleotide smo modificirali tako, da smo en zunanji ostanek gvanina zamenjali z uracilom v prvem, tretjem in četrtem G-traktu Pridobili smo oligonukleotide z vsemi štirimi G-trakti enake dolžine, kar preprečuje G-registrsko izmenjavo. Njihovi 1D 1H spektri so imeli ozke in ostre signale, število signalov je odgovarjalo pričakovanemu za trikvartetni G-kvadrupleks, kar je pokazatelj prisotnosti samo ene vrste strukture v vsakem primeru. Kot model smo izbrali enega od G-kvadrupleksov, ki je prisoten v ansamblu struktur, ki jih tvori nativno zaporedje. To je oligonukleotid, označen kot SP_4-19-21 (na položajih 4, 19 in 21 je bil namesto gvanina uveden uracil), za njegov vzorec pa smo posneli serijo 1D in 2D NMR spektrov. Za nedvoumno asignacijo imino-signalov smo sintetizirali selektivno 15N izotopsko označene oligonukleotide in posneli 1D 1H-15N HSQC spektre. Asignacijo ostalih signalov smo izvedli z analizo 2D spektrov. 2D 1H-1H NOESY spektri prikazujejo prostorsko korelacijo protonov H1 in H8 različnih gvaninskih ostankov v istem G-kvartetu in so bili uporabljeni za določitev, kateri gvaninski ostanki sestavljajo posamezan G-kvartet. Ugotovili smo, da nastali G- kvadrupleks zaseda paralelno topologijo, kar je v skladu z literaturnimi podatki, ki nakazujejo da RNA gradi predvsem paralelne G-kvadruplekse. 2D 1H-1H NOESY spekter kaže tudi povezave med sosednjimi ostanki ((n)(H8/6 – (n)H1\u27 – (n+1)H8/6 korelacije), če so nukleotidi v anti-konformaciji, kar je specifično za paralelno G-kvadrupleksno topologijo. Poleg spektrov 1H-1H NOESY smo posneli še številne druge 2D spektre, kot so 1H-13C HSQC, 1H-1H COSY in 1H-1H DQF-COSY spektre, ki so nam omogočili natančno asignacijo signalov, ter zagotovili podatke o konformaciji sladkornih komponent gvaninskih ostankov G-kvadrupleksa. Ugotovili smo, da so ribofuranozni obroči gvaninov, ki sestavljajo zunanje G-kvartete, prisotni v C2\u27-endo (S-konformacija), medtem ko so gvaninski ribofuranozni obroči v notranjem G-kvartetu v C3\u27-endo konformaciji (N-konformacija). Poleg tega smo uporabili tehnike ultravijolične spektroskopije (UV) in spektroskopije cirkularnega dikroizma (CD), s čem smo dopolnili podatke o strukturi in lastnostih nastalih G-kvadrupleksov, ki jih tvori tako nativno zaporedje, kot mutirani oligonukleotidi. UV spektroskopija nam je omogočila preučevanje toplotne stabilnosti G-kvadrupleksov. Pokazali smo, da je temperatura taljenja in denaturacije sekundarne strukture G-kvadrupleksa približno 70°C. Prav tako je iz krivulj, dobljenih pri poskusu kjer se UV spektroskopija uporablja v kombinaciji s temperaturno denaturacijo vzorca, razvidno, da procesa tvorbe kvadrupleksa in denaturacije potekata v enem koraku. CD spektroskopija je potrdila predpostavljeno paralelno topologijo G-kvadrupleksa. Vsaka oblika G-kvadrupleksne topologije (paralelna, antiparalelna in hibridna) ima specifičen spekter CD spekter. Ker se spektri, pridobljeni za izbrani oligonukleotid, ujemajo z vzorci spektrov paralelnega G-kvadrupleksa iz literature, je predpostavka nedvoumno potrjena. Izvedli smo tudi nativno poliakrilamidno gelsko elektroforezo (PAGE), s katero smo potrdili molekularnost nastalega G-kvadrupleksa. Lise nativnega in mutiranih oligonukleotidov so bili opaženi med referenčnimi standardi, dolgimi 20 in 30 nukleotidov. Ker so testirani oligonukleotidi dolgi 27 nukleotidov, sklepamo, da so vsi G-kvadrupleksi monomolekulareni, tj. pri njegovi gradnji sodeluje samo ena veriga oligonukleotida. Literatura vsebuje tudi podatke o ligandih in proteinih, ki povečujejo stabilnost G-kvadrupleksov. Najbolj znan stabilizirajoči G-kvadrupleksni ligand je derivat biskvinolinija PhenDC3, ki kaže visoko afiniteto za G-kvadruplekse, pa tudi selektivnost za ta motiv v primerjavi z drugimi možnimi sekundarnimi strukturami nukleinskih kislin. V literaturi je navedeno, da se PhenDC3 s svojim sistemom aromatičnih obročev nalaga na zgornji ali spodnji G-kvartet in z njim tvori stabilizirajoče π - π interakcije. Vzorec oligonukleotida SP_4-19-21 smo titrirali z raztopino PhenDC3 in opazili spremembe v 1D 1H NMR spektru po dodatku vsake polovice ekvivalenta liganda. Opazili smo, da do nadaljnjih sprememb v spektru ne pride po trenutku, ko sta RNA in ligand v raztopini v razmerju 1:1.5. Glede na takšno stehiometrijo lahko domnevamo, da ligand ni prisoten na obeh straneh G-kvadrupleksa hkrati, ampak se izmenično veže na zgornji ali spodnji G-kvartet. Nastali kompleks smo preučevali z NMR spektroskopijo na enak način kot prosti oligonukleotid. Z 2D 1H-1H ROESY spektrom smo potrdili, da se ligand izmenjuje med zgornjim ali spodnjim G-kvartetom kot je predlagano v literaturi. Potrjeno je bilo tudi, da je topologija G-kvadrupleksa v kompleksu z ligandom ostala paralelna, torej nespremenjena, kar vodi do zaključka, da ligand učinkovito stabilizira obstoječi G-kvadrupleks, ne da bi vplival na mehanizem njegovega nastanka. Topologijo kompleksa smo potrdili tudi s CD spektroskopijo. Ponovno smo dobili spekter, ki ustreza standardnemu spektru paralelnega G-kvadrupleksa. V literaturi je opisano, da TMPRSS2 nima ključne vloge pri preživetju celic in organizmov. Študije na miših kažejo, da imajo tudi laboratorijske živali, pri katerih je izbit gen za TMPRSS2, normalne funkcije v smislu normalnega razvoja, rasti in delovanja organov. Zato lahko domnevamo, da ima zaviranje translacije z nastankom G-kvadrupleksa v območju 5-\u27UTR mRNA TMPRSS2 potencialno vlogo pri preprečevanju ali vsaj upočasni razvoj bolezni COVID-19. Pomembno je omeniti tudi podatke iz literature, da ligand PhenDC3, ki stabilizira G-kvadrupleks, nima toksičnih učinkov na celico in bi ga lahko uporabili v terapevtske namene. Za potrditev te predpostavke o terapevtski vlogi tvorbe G-kvadrupleksa v boju proti COVID-19 je vsekakor treba izvesti dodatne raziskave in vitro in in vivo