Modulación deTDP-43: una nueva estrategia terapeútica para la esclerosis lateral amotrófica

229 p.-95 fig.-11 tab.-anexo[EN]The prevalence of neurodegenerative diseases increases daily due to the longer life expectancy of the population as there are age-dependent diseases. The most common disorders by the number of patients are Alzheimer´s disease, Parkinson´s disease and in a lower range amyotrophic lateral sclerosis commonly known as ALS. ALS is a lethal motor neuron disease characterized by the progressive muscle paralysis due to the upper and lower motor neuron degeneration being the average survival from onset to death between 3-4 years. The unknown etiology and the lack of effective treatment highlighted the urgent need to discover effective disease-modifying targets and therefore effective treatments to prevent and stop disease progression. ALS is considered as a multifactorial disorder where a combination of environmental and genetic factors contributes to motorneuron degeneration. Protein aggregates with different posttranslational modifications such as hyperphosphorylation and ubiquitination, is one of the most common biomarkers among neurodegenerative diseases. The main pathological hallmark in almost 97% of ALS patients is the presence of TDP-43 protein aggregates in the cytoplasm of the affected cells promoted by the aberrant phosphorylation and other post-translational modifications. TDP-43 is a nuclear protein involved in the regulation of multiple cellular processes as it regulates the transcription and transport of more than 600 mRNA. The dynamic equilibrium of TDP-43 between nucleus and cytoplasm is altered in disease-affected neurons causing a dysregulation of several mechanisms. Therefore, the inhibition of protein kinases involved in the abnormal phosphorylation of TDP-43 has emerged as a promising therapeutic approach for ALS in order to recover TDP-43 homeostasis and therefore multiple signalling pathways.With this purpose, we have carried out a medicinal chemistry program where the thesis “TDP-43 modulation: a novel therapeutic approach for Amyotrophic Lateral Sclerosis” have taken place, whose the main goal has been the validation of protein kinases as new therapeutic targets and the develop of protein kinases inhibitors as valuable drugs to treat ALS and TDP-43 proteinopathy disorders. Firstly, we have performed a screening in our in-house MBC chemical library, selecting small molecules with potent and selective activity against protein kinases involved in the hyperphosphorylation of TDP-43 (CK-1, CDC7, TTBK1 and GSK-3β), with high permeable ability to cross the blood brain barrier.To assess the neuroprotective properties of these compounds, we used different in vitro and in vivo models. Potential modulation of TDP-43 pathology was first evaluated in a human neuroblastoma cell line model where most of the compounds showed ability to decrease TDP-43 phosphorylation upon ethacrynic acid treatment. We next stablished a human cellular model based on the immortalization and characterization of lymphocytes from ALS patients and healthy subjects. Altered TDP-43 homeostasis observed in ALS immortalized lymphocytes was recovered after treatment with selected compounds by decreasing TDP-43 phosphorylation, truncation and normalizing TDP-43 nuclear localization.The involvement of different mechanism in ALS pathogenesis highlighted the need for a therapeutic approach targeted to multiple aspects. Therefore, we have tested selected drugs in an LPS-induced neuroinflammation model developed in rat primary microglial cultures.Finally, the best pharmacological agents were tested in TDP-43 transgenic mice, where we observed in all cases a reduction in TDP-43 phosphorylation and a neuroprotective and/or anti-inflammatory effect in the lumbar spinal cord of transgenic mice when treated with protein kinases inhibitors.Given the high failure rates and the length of time required for new drug development, we consider the “drug repurposing strategy” as the best approach to accelerate drug discovery process and therefore find an effective treatment for diseases that lack of it. Find new applications that are outside the scope of the original medical indications of a drug, is what we have made with Tidegluib, an in-house designed ATP-non-competitive GSK-3β inhibitor, that have shown good safety and tolerability in patients with different neurological disorders.With this aim we havetested its neuroprotective effect in several in vitro and in vivo models. The promising results obtained propose the repurposing of Tideglusib as a good therapeutic strategy for ALS treatment.In view of these results, the inhibition of protein kinases involved in the aberrant TDP-43 phosphorylation by small molecules with brain high-permeable ability could be a novel strategy for the treatment of ALS as they recover TDP-43 homeostasis, the main hallmark of the disease.[ES]Los grandes avances en el campo de la medicina han contribuido al aumento de la esperanza de vida media de la población. Este hecho va ligado al incremento del número de casos de enfermedades neurodegenerativas, siendo las más incidentes la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. La esclerosis lateral amiotrófica, conocida como ELA, es la enfermedad de neurona motora más frecuente en adultos. Aunque es una enfermedad rara, el aumento considerable del número de casos en los últimos años ha hecho que su visibilidad sea cada vez mayor. Esta patología se caracteriza por la pérdida progresiva de neuronas motoras que acaba derivando en una parálisis muscular de pronóstico mortal, siendo la esperanza de vida media desde el diagnostico de 3 a 4 años. La búsqueda de terapias efectivas que consigan frenar la degeneración neuronal de esta devastadora enfermedad es de gran necesidad puesto que los dos únicos fármacos aprobados son paliativos y tan solo son capaces de alargar la vida de los pacientes de 3 a 6 meses. La ELA, al igual que la mayoría de patologías neurodegenerativas, es una enfermedad multifactorial, es decir, la muerte neuronal es consecuencia de la suma de diversos procesos celulares patológicamente alterados. Un biomarcador común a todas ellas, es la presencia de agregados proteicos citoplasmáticos en las células afectadas como consecuencia de modificaciones post-traduccionales anómalas que sufren en su estructura, como es la hiperfosforilación y la ubiquitinación. La característica patológica principal presente en los tejidos de un 97% de pacientes con ELA, es la agregación citoplasmática de TDP-43 fosforilada y ubiquitinada. TDP-43 regula la expresión de más de 600 ARNm a nivel nuclear, sin embargo, en estado patológico se trasloca al citoplasma y agrega produciéndose en consecuencia una desregulación de numerosos procesos celulares. De ahí la importancia que adquiere la búsqueda de fármacos que reestablezcan la homeostasis de esta proteína tan esencial. Así, el desarrollo de inhibidores de las proteínas quinasas implicadas en la fosforilación de TDP-43, ha adquirido gran relevancia en la comunidad científica y, en concreto, en este grupo de investigación, cuya práctica en el desarrollo de inhibidores de quinasas para diferentes patologías, cuenta con más de 20 años de experiencia. Con esta intención, se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral bajo el nombre: “Modulación de TDP-43: una nueva estrategia terapéutica para la esclerosis lateral amiotrófica”, cuyo principal objetivo es la validación de las proteínas quinasas que modulan la fosforilación de TDP-43 como dianas terapéuticas, así como el desarrollo de sus inhibidores como candidatos a fármacos para la ELA y aquellas patologías que cursen con esta proteinopatía.Concretamente, se ha llevado a cabo el desarrollo preclínico de pequeñas moléculas de la quimioteca MBC del grupo de investigación, que presentan actividad inhibitoria frente a las quinasas que modulan la fosforliación de TDP-43: CK-1, CDC7, TTBK1 y GSK-3β. Para ello, se realizó en primer lugar una selección en base a la selectividad y a la actividad inhibitoria que presentan dichos compuestos, evaluando posteriormente la capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica y llegar a su órgano diana: el sistema nervioso central. Una vez seleccionados los mejores agentes farmacológicos, se evaluó su potencial terapéutico en diferentes modelos celulares y animales que recapitulan la proteinopatía de TDP-43. En primer lugar, se validó el efecto neuroprotector frente a la hiperfosforlación de TDP-43 en un ensayo fenotípico desarrollado en la línea de neuroblastoma humano SH-SY5Y. A continuación, se procedió a la inmortalización y caracterización de células mononucleares de sangre periférica procedente de donantes sanos y de pacientes con ELA, estableciéndose como modelo para evaluar el potencial terapéutico de los compuestos, puesto que recapitulan las características patológicas de la enfermedad. Por último, y dado que la ELA es una enfermedad multifactorial, se evalúo el efecto inmunomodulador de determinados compuestos en un modelo de neuroinflamación desarrollado en cultivos primarios de microglía murina. Ante los prometedores resultados obtenidos en los ensayos celulares, se evalúo el potencial neuroprotector de un inhibidor representativo de cada quinasa en el modelo de ratón transgénico que sobreexpresa TDP-43 con la mutación A315T. Todos los candidatos a fármaco mostraron una eficacia significativa a la hora de modular la fosforilación patológica de TDP-43 in vivo, presentando a su vez un efecto neuroprotector y antiinflamatorio observado a nivel histológico y/o comportamental en función del inhibidor de estudio. Todo este procedimiento de desarrollo de un fármaco es un proceso de larga duración y con un elevado coste económico. Sin embargo, existe lo que se conoce como “reposicionamiento de fármacos”, es decir, la búsqueda de nuevas aplicaciones terapéuticas a fármacos cuya seguridad ha sido probada en humanos, bien porque están en ensayos clínicos, o porque ya han sido aprobados por las agencias reguladoras. Por ello, se propuso el reposicionamiento de Tideglusib, un inhibidor ATP-no competitivo de GSK-3β diseñado en el grupo de investigación, como la aproximación más rápida para la búsqueda de terapias efectivas para esta enfermedad, puesto que su seguridad y eficacia ha sido evaluada en humanos para otras patologías neurológicas. El significativo efecto neuroprotector que presentó Tideglusib en los modelos celulares y animales establecidos para el estudio de la ELA, ha llevado al diseño de un ensayo clínico fase II, que se iniciará en Suiza en cuanto el protocolo sea aprobado. En conclusión, los inhibidores de las cuatro quinasas propuestas han mostrado una eficacia significativa a la hora de recuperar la homeostasis de TDP-43, reduciendo la hiperfosforilación y fragmentación, y en consecuencia, recuperando la localización nuclear de esta proteína en los modelos celulares y animales establecidos para el estudio de la ELA. Estos resultados son prometedores y avalan la inhibición de las quinasas que modulan la fosforilación patológica de TDP-43, descrita en la mayoría de pacientes, como una buena estrategia terapéutica para el tratamiento de esta proteinopatía y en concreto de la ELA.Proyecto ELA-Madrid (financiado por la Comunidad de Madrid y la Unión Europea, ELA-MADRID.B2017/BMD-3813).Peer reviewe