Seguimiento epidemiológico, genómica comparativa y análisis filogenético de aislamientos monofásicos de Salmonella enterica serotipo Typhimurium y de otros serotipos con resistencias emergentes

Tesis doctoral presentada para lograr el título de Doctor en Biología Molecular y Celular por la Universidad de Oviedo.--2021-12-20.--Sobresaliente cum laudeLos serotipos no tifoideos de Salmonella enterica constituyen una de las causas principales de infecciones bacterianas transmitidas por alimentos, con estimaciones de más de 100 millones de casos por año a nivel mundial. Estos serotipos originan normalmente una forma de infección intestinal autolimitada, conocida comúnmente como salmonelosis, que se caracteriza por diarrea más o menos severa, dolor abdominal, náuseas, vómitos, dolor de cabeza y fiebre. Sin embargo, en niños, ancianos y personas inmunocomprometidas, la bacteria puede extenderse fuera del intestino, originando infecciones sistémicas graves e incluso mortales. Aunque el tratamiento con agentes antimicrobianos no es necesario en casos de salmonelosis sin complicaciones, resulta esencial para combatir infecciones invasivas y prevenirlas en pacientes con factores de riesgo. En estas circunstancias, los antimicrobianos de elección son las cefalosporinas de amplio espectro y las fluoroquinolonas, estas últimas contraindicadas en niños. En esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de aislamientos de S. enterica pertenecientes a la variante monofásica del serotipo Typhimurium, con elevada incidencia a nivel mundial, y de otros serotipos con resistencias emergentes. Se utilizaron para ello técnicas experimentales, junto con secuenciación y análisis genómico. La primera parte de la Tesis se centró en el estudio de la variante monofásica, determinando su incidencia en el Principado de Asturias (PA) durante el periodo 2008-2018. Se analizaron un total de 741 aislamientos de los cuales 615 (83%) procedían de muestras clínicas y los 126 restantes (17%) de alimentos. En base al fenotipo de resistencia/genes responsables y su localización, estos aislamientos se asignaron a tres clones: los clones español y sud-europeo, que contienen plásmidos híbridos de resistencia-virulencia pertenecientes a los grupos de incompatibilidad IncC e IncR, respectivamente, y el clon europeo, con resistencia cromosómica, siendo este último prevalente en el PA. La secuenciación de genomas de aislamientos pertenecientes a los tres clones se llevó a cabo utilizando las plataformas Illumina y PacBio de segunda y tercera generación, respectivamente. Las lecturas obtenidas con Illumina (90-150 pb) fueron ensambladas mediante PLACNETw, lo cual permitió reconstruir los componentes de cada genoma: cromosoma y plásmido(s). En todos los casos, los genomas fueron anotados con PGAP, depositados en la base de datos pública GenBank y analizados con numerosas herramientas bioinformáticas. La caracterización de los aislamientos permitió identificar variantes de los perfiles de resistencia de estos clones, asociadas a la pérdida, ganancia o pérdida y ganancia de uno o más genes de resistencia. De especial relevancia fue la adquisición, por parte del clon europeo, de genes de resistencia a cefalosporinas de amplio espectro, sin o con resistencia simultánea a cefamicinas (blaCTX-M-9, blaCTX-M-14 y blaCMY-2), fluoroquinolonas (qnrA1) y/o colistina (mcr-1 y mcr-9), así como la localización de estos genes en plásmidos transferibles pertenecientes a diferentes grupos de incompatibilidad: IncHI2, IncI1 o IncX4. Estas resistencias también se encontraron en aislamientos del clon europeo procedentes de un hospital del País Vasco, incluidos en el estudio. En relación a este clon, destaca además la selección post-tratamiento de resistencia a fluoroquinolonas y piperacilina/tazobactam, asociada a un caso atípico de neumonía que afectó a un paciente ingresado en la UCI de un hospital del PA. La adquisición de resistencia a piperacilina/tazobactam es de gran importancia, ya que esta combinación de fármacos se administra de forma empírica para el tratamiento de pacientes con infecciones invasivas ingresados en la UCI.El análisis bioinformático, además de corroborar y complementar los resultados obtenidos de manera experimental, aportó información adicional sobre los aislamientos objeto de estudio, en concreto sobre secuencias tipo (ST), genes de resistencia a metales pesados y antisépticos, genes de virulencia y elementos genéticos implicados en resistencia y virulencia, como plásmidos (la mayoría también identificados de manera experimental), regiones de resistencia e islas genómicas, islas de patogenicidad de Salmonella (SPIs) y profagos. Los resultados obtenidos mostraron una alta variabilidad intra- e inter-clon, especialmente en cuanto a perfiles de resistencia a antibióticos, perfiles plasmídicos y perfiles de profagos. Sin embargo, el contenido en genes virulencia y SPIs prácticamente coincidieron en todos los aislamientos analizados, encontrándose únicamente diferencias en el gen fágico sopE, solamente identificado en algunos de ellos. Finalmente, el análisis de las relaciones filogenéticas (intra e inter-clon), establecidas en base a SNPs detectados en los genomas completos, permitió la identificación de dos clados bien diferenciados. Uno de ellos agrupó a los aislamientos de los clones español y sud-europeo, con secuencia tipo ST19, y el otro a los del clon europeo, con secuencia tipo ST34. Dentro del primer clado, los aislamientos de los clones español y sud-europeo se separan claramente en dos sub-clados. La segunda parte de la tesis incluyó la secuenciación y caracterización de 26 aislamientos pertenecientes a los serotipos Bredeney, Corvallis, Enteritidis, Infantis, Kentucky, Kedougou, Paratyphi B y Typhimurium, con resistencias relevantes. 23 se obtuvieron de muestras clínicas de hospitales del PA, Cantabria y País Vasco y los 3 restantes de muestras de alimentos del PA. En todos ellos se determinaron las bases genéticas de la resistencia a cefalosporinas de amplio espectro/cefamicinas (genes blaCTX-M-1, blaCTX-M-9, blaCTX-M-14, blaCTX-M-65 y blaCMY-2), fluoroquinolonas (diferentes combinaciones de mutaciones puntuales en los genes cromosómicos gyrA y parC, así como la presencia del gen de resistencia plasmídico qnrS1) y colistina (genes mcr-1 y mcr-4). Muchos de estos genes se localizaron en plásmidos, de los grupos IncHI2 (blaCTX-M-9), IncI1 e IncF (blaCTX-M-14), IncP (blaCTX-M-65), IncC (blaCMY-2), IncX4 (mcr-1), ColE10 y ColE1 (qnrS1). La Tesis Doctoral puso de manifiesto la eficacia del análisis genómico, como complemento del trabajo experimental, para el seguimiento de bacterias resistentes y la determinación de bases genéticas de la resistencia y la virulencia. El trabajo generó información exhaustiva sobre la situación de S. enterica en el PA, de gran interés a la hora de abordar la vigilancia epidemiológica y control de esta importante bacteria patógena