Reorganização temporal dos circuitos prefrontais durante o processo de consolidação da memória

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaAs memórias de eventos não são guardadas na sua forma definitiva, sofrendo um processo de estabilização ao longo do tempo. O desenvolvimento de técnicas que permitem estudar especificamente os neurónios que guardam as memórias (células engrama) levou a uma forte investigação concentrada no processo de consolidação. Este processo ocorre com um diferente envolvimento de diferentes regiões cerebrais no suporte da memória ao longo do tempo. Uma das regiões que se torna mais importante à medida que a memória amadurece é o córtex prefrontal medial (mPFC). Estudos reportam a sua maior atividade e que a sua inativação leva à incapacidade de recuperar a memória, em tempos remotos após a aprendizagem. Para além disso, os neurónios piramidais desta região mostram um aumento gradual do número de espinhas dendríticas, sugerindo uma alteração na conectividade aferente. Assim, o objetivo deste projeto foi compreender se o recrutamento do mPFC para a expressão da memória em tempos remotos ocorre simultaneamente com as mudanças na conectividade aferente das células engrama. Para documentar a reorganização das conexões do mPFC durante a consolidação da memória, usámos uma abordagem inovativa de tracing viral, a mono-transynaptic tracing baseada em recombinant pseudo-typed rabies vírus, num sistema TetTag. Ao combinar estas técnicas com o labirinto radial de oito braços (8ARM), identificámos os neurónios ativos durante o comportamento e as suas conexões pré-sinápticas num curto e longo período após a aprendizagem. Curiosamente, encontrámos uma tendência para uma diminuição de conetividade aferente em tempos remotos, com menos aferentes corticais, à exceção dos locais no mPFC, e um envolvimento diferente de cada núcleo talâmicos ao longo do tempo. Estes resultados são, contudo, preliminares e um aumento da amostragem é essencial para confirmar a informação. Experiências de otimização do sistema TetTag foram também realizadas, uma vez que este sistema requer doxiciclina (DOX) para regular a marcação neuronal. Definimos uma janela apropriada para remoção do DOX (48h sem DOX para contextual fear conditioning e 8ARM) e controlámos marcação inespecífica fora da janela desejada através de injeções intraperitoneais de DOX.Memories of events are not acquired in their definitive form upon encoding but undergo a gradual process of stabilization over time. Recent technical advances have allowed to specifically study the memory-holding neurons, the engram cells, with numerous studies focusing their attention on the process known as systems consolidation. This process occurs in distributed neural systems, with a differential involvement of brain regions that support memory over time. One region that becomes increasingly important as memory ages is the medial prefrontal cortex (mPFC), shown by its increased activity in remote timepoints and its inactivation leading to impairments in remote memory recall. Additionally, findings show that in associative learning there is a gradual increase in the number of spines on pyramidal neurons of the mPFC over time, suggesting an alteration in the afferent connectivity into this region. Hence, the aim of this project was to understand if the recruitment of the mPFC for remote memory recall occurs concomitantly with changes in engram’s afferent connectivity.To document the reorganization of mPFC connections occurring during memory consolidation, we used an innovative viral tracing approach, the mono-trans-synaptic tracing, based on recombinant pseudo-typed rabies virus, in a TetTag system. Combining these techniques with the Eight-Arm Radial Maze (8ARM), we identified the neurons engaged during the behavioural task and traced their presynaptic connections at a recent and remote timepoint. Interestingly, we report a tendency to a decrease in afferent connectivity in remote timepoints compared to recent, with less cortical afferents, expect for local mPFC connections, and a differential involvement of thalamic nuclei through time. These results are however preliminary and an increase in replicas is essential to confirm the data. Protocol optimization experiments for the TetTag system were also performed, as this system depends on doxycycline to regulate neuronal labelling. We defined the appropriate DOX-off window for neuronal tagging (48h off DOX in contextual fear conditioning and 8ARM) and prevented unspecific labelling outside the desired window by means of DOX intraperitoneal injections