Preclinical impact of blueberry supplementation in healthy and prediabetic conditions - Focus on gut microbiota and hepatic mitochondria bioenergetics

Tese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, Farmacologia e Farmacoterapia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.Prediabetes, recognized as a state of high risk for the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM) and related complications, is certainly a privileged phase to implement strategies to prevent or delay the disease progression to more advanced stages. Unhealthy lifestyles, marked by sedentarism and unbalanced dietary habits, are important contributors to the growing incidence of various metabolic disorders, namely prediabetes. Several recent evidence point towards unbalanced diets, including the hypercaloric ones, as major drivers of gut microbiota (GM) dysbiosis, which may be involved in the onset of metabolic deregulation. Although the putative engagement of dysbiosis as early as prediabetes remains to be elucidated, the adoption of healthier dietary regimens as a first-line therapy is now well established. During the recent years, we have witnessed a change in consumers´ attitude towards the adoption of healthier dietary patterns to avoid the onset of certain diseases while ensuring a better life quality. Thus, the demand and consumption of functional foods and natural supplements rich in phytochemicals, namely polyphenols, are a contemporary trend. Still, high doses of phenolic compounds have already been associated with adverse effects, namely at the hepatic level, a controversial issue within the scientific community that warrants further studies. Blueberry (BB) fruit has become popular, both to be consumed as a food or as a supplement, by virtue of their claimed health benefits (e.g. antioxidant, prebiotic), as they are a valuable source of bioactive compounds (i.e. polyphenols and fiber). Even so, the effective consequences of its excessive intake in a healthy condition are yet to be defined. Likewise, a lack of consistent evidence subsists regarding the expected positive impact of a BB-derived nutraceutical intervention in a prediabetic condition, presumed on the basis of its panoply of health-related properties in several metabolic diseases, including in T2DM. Considering these rationales, the main aims of this thesis were the evaluation of the effects arising from a long-term BB supplementation, in healthy and prediabetic conditions, with particular focus on GM and liver tissue. BB was administered in the juice form, in a dose of 25 g/Kg of body weight for 14 weeks in two experimental conditions: a) in healthy Wistar rats and b) in a hypercaloric diet- induced prediabetic rat model. When a healthy condition was foreseen, our observations corroborated the expected increase in antioxidant activity BB-driven, accompanied by an unchanged metabolic profile. Somewhat surprisingly, no profound changes were observed in the composition and function of the microbial community. In the liver, BB supplementation elicited a scenario of mitochondrial adaptation without functional and structural changes in the hepatic tissue. Indeed, we found a marked remodeling of mitochondrial bioenergetics, accompanied by a reprogramming of metabolic transcriptomics and an expressive repression of inflammation-related genes. Collectively, these observations suggest the activation of an adaptive cellular response to an overload of the antioxidant cargo triggered by a prolonged consumption of BB. Regarding the impact of BB on prediabetes, we observed a prevention of hypercaloric diet-evoked metabolic changes. Apparently, this metabolic protection could not be explained by the impact on GM. Conversely, and paralleling an antioxidant effect, we observed a reduction in hepatic steatosis along with a clear improvement in hepatocyte mitochondrial bioenergetics, suggesting that mitochondria may be a key player in early disease progression. Moreover, BB consumption has positively modulated the hepatic gene expression of key targets involved in fatty acid oxidation, insulin signaling, inflammation, as well as the mitochondrial respiratory chain, all of which were found compromised in the liver of prediabetic rats. Collectively, these results advocate that the improvement of hepatic mitochondrial function may be a crucial mechanism by which BB exerts its protective effect in prediabetes. In conclusion, the results of this thesis suggest that the long-term supplementation of BB may be an effective nutraceutical intervention to avoid the progression of prediabetes; still, the marked impact on hepatic mitochondrial bioenergetics in a healthy condition raises the need of further studies for full clarification.A pré-diabetes, reconhecida como um estado de risco elevado para o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) e de complicações a ela relacionadas, é certamente uma fase privilegiada para implementar estratégias para prevenir ou retardar a progressão da doença para fases mais avançadas. Os estilos de vida pouco saudáveis, marcados pelo sedentarismo e hábitos alimentares desequilibrados, têm contribuído para a crescente incidência de várias doenças metabólicas, nomeadamente a pré-diabetes. Diversas evidências recentes apontam no sentido de que dietas desequilibradas, incluindo as hipercalóricas, contribuem para a disbiose da microbiota intestinal, que poderá estar envolvida na origem da desregulação metabólica. Embora uma ligação entre a disbiose e a pré-diabetes permaneça por provar, é hoje perfeitamente aceite que a adoção de regimes alimentares mais saudáveis é a primeira linha de intervenção terapêutica. Nos últimos anos, temos assistido a uma mudança de atitude dos consumidores no sentido de privilegiar padrões alimentares mais saudáveis, de forma a evitar o aparecimento de certas doenças e garantir uma melhor qualidade de vida. Assim, o aumento da procura e do consumo de alimentos funcionais e suplementos naturais ricos em fitoquímicos, nomeadamente polifenóis, é uma tendência contemporânea. Contudo, doses elevadas de compostos fenólicos foram já associadas a efeitos adversos, nomeadamente a nível hepático, um assunto controverso dentro da comunidade científica que reforça a importância de estudos adicionais. O mirtilo (BB) tornou-se popular, tanto para ser consumido sob a forma de alimento como de suplemento, em virtude dos seus alegados efeitos benéficos para a saúde (p.ex., antioxidante e pré-biótico) uma vez que são uma valiosa fonte de compostos bioativos (i.e., polifenóis e fibras). No entanto, as consequências precisas do seu consumo excessivo numa condição saudável ainda não estão definidas. Da mesma forma, persistem dúvidas no que diz respeito à presumível proteção do BB como intervenção nutracêutica eficaz na pré-diabetes, apesar de já terem sido descritas propriedades benéficas em várias doenças metabólicas, incluindo na DMT2. Tendo em consideração estes fundamentos, os principais objetivos desta tese foram a avaliação do impacto de uma suplementação prolongada de BB numa condição saudável e na pré-diabetes, com particular destaque para a microbiota intestinal e o tecido hepático. O BB foi administrado sob a forma de sumo, numa dose de 25 g/Kg de peso corporal, durante 14 semanas, em duas condições experimentais: a) em ratos Wistar saudáveis e b) num modelo de pré-diabetes induzido com recurso a uma dieta hipercalórica. Na condição saudável, as nossas observações corroboraram o esperado aumento da atividade antioxidante nos animais suplementados com BB, sem alterações do perfil metabólico. De forma algo surpreendente, não foram observadas modificações na composição e função da comunidade microbiana intestinal. A nível hepático, o BB desencadeou um cenário de adaptação mitocondrial sem alterações tecidulares, tanto estruturais como funcionais. De facto, constatámos uma acentuada remodelação da bioenergética mitocondrial, acompanhada de uma reprogramação da transcriptómica metabólica e uma repressão expressiva de genes relacionados com a inflamação. Coletivamente, estes resultados sugerem a ativação de uma resposta celular adaptativa a uma sobrecarga antioxidante desencadeada por um consumo prolongado de BB. Relativamente ao impacto do BB na pré-diabetes, observámos uma prevenção das alterações metabólicas induzidas pela dieta hipercalórica. Aparentemente, esta proteção metabólica não pode ser explicada pelo impacto na microbiota intestinal. Em contrapartida, e em paralelo ao efeito antioxidante, observámos uma redução da esteatose hepática acompanhada por uma melhoria significativa da bioenergética mitocondrial do hepatócito, sugerindo que a mitocôndria possa ser uma peça-chave na progressão inicial da doença. Além disso, o consumo de BB modulou positivamente a expressão génica a nível hepático de alvos-chave da oxidação de ácidos gordos, sinalização de insulina, inflamação e cadeia respiratória mitocondrial, todos eles comprometidos nos animais pré-diabéticos. Coletivamente, estes resultados defendem que a melhoria da função mitocondrial hepática pode ser um mecanismo crucial através do qual o BB exerce o seu efeito protetor na pré-diabetes. Em conclusão, os resultados desta tese sugerem que a suplementação prolongada de BB pode ser uma intervenção nutracêutica eficaz para prevenir a progressão da pré-diabetes, embora o impacto significativo na bioenergética mitocondrial hepática, em condição saudável, recomende estudos adicionais para cabal clarificação.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT