Acurácia da reação em cadeia de polimerase em tempo real para o diagnóstico da hanseníase em diferentes fases do sangue periférico : um modelo diagnóstico e de disseminação do Mycobacterium leprae

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2022.Acredita-se que a hanseníase é a doença infectocontagiosa mais antiga da humanidade e até os dias de hoje, é um problema público de saúde mundial. Segundo a OMS, 161 países relataram dados sobre a doença em 2019 e o total de novos casos atingiu 202.256. O Brasil, país englobado no grupo prioritário de controle à doença, no mesmo ano, notificou 27.864 incidentes, sendo destes 2.351 classificados com Grau de Incapacidade Física - GIF 2 e 1.545 casos infantis. Uma vez que o diagnóstico da enfermidade é exclusivamente clínico e que os exames laboratoriais hoje existentes servem apenas como instrumento de auxílio, é importante desenvolver uma ferramenta diagnóstica que seja menos invasiva, pouco onerosa para os cofres públicos e que possibilite a confirmação do quadro clínico relatado pelo médico. Este estudo propõe a detecção do Mycobacterium leprae nos diferentes componentes do sangue total periférico, por meio da Reação em Cadeia de Polimerase em tempo real e a quantificação da bactéria. A população de estudo consistiu nos pacientes com suspeita de hanseníase, atendidos no Hospital Universitário de Brasília, compreendidos no período de um ano entre junho de 2020 e junho de 2021, totalizando 111 pacientes, sendo 55 diagnosticados positivamente para hanseníase, conforme orientações do Ministério da Saúde, e 56 suspeitos, mas não diagnosticados, como sendo controles. Após a obtenção do soro, plasma, concentrado de hemácias e células mononucleares do sangue periférico, os mesmos foram submetidos à extração de DNA por meio de kit comercial Purelink Genomic da Thermofisher Scientific. Para a padronização dos controles positivos e reação da curva padrão de quantificação, foi confeccionado o alvo genético RLEP do genoma da micobactéria. A qPCR foi feita de forma qualitativa e quantitativa utilizando os primers RLEPBR F -5’ – CTTGCACCATTTCTGCCGCT – 3’ e RLEPBR R – 5’ – TGCGCTAGAAGGTTGCCGTA – 3’. Dos participantes diagnosticados clinicamente com hanseníase, 52,73% eram do sexo feminino, a idade média foi de 44,33 anos e nenhum era contactante. Dos participantes do grupo controle, 50% eram do sexo masculino, a idade média foi de 45,11 e 48 eram contactantes. Pela classificação do quadro clínico, 1 participante era indeterminado, 5 tuberculóide-tuberculóide, 8 dimorfo-tuberculóide, 18 dimorfo-dimorfo, 11 dimorfovirchowiana, e 12 virchowiana-virchowiana. Quanto ao GIF, 17 pacientes eram GIF 1, 15 GIF 2 e 23 GIF 0. Quanto aos resultados biomoleculares, a sensibilidade foi baixa correspondendo a 11,54% no soro, 7,31% no plasma, 9,26% nas células mononucleares do sangue periférico, 9,80% no concentrado de hemácias e na baciloscopia de 38,18%. Entre os pacientes paucibacilares, a maior sensibilidade foi para o soro e para o concentrado de hemácias e entre os multibacilares a maior sensibilidade foi encontrada no soro. A baixa sensibilidade encontrada nos resultados indica que o sangue periférico não é um material consistente para diagnosticar a hanseníase.It is believed that leprosy is the oldest infectious and contagious disease of the humanity and until today it is a public health problem worldwide. According to WHO, 161 countries reported data on the disease in 2019 and the total of new cases reached 202.256. Brazil, a country included in the priority group for the disease control, in the same year reported 27.864 incidents, of which 2.351 were classified as Disability Degree 2 and 1.545 were child cases. Since the diagnosis of the disease is exclusively clinical and the laboratory tests that exist today are used only as an aid tool, it is important to develop a less invasive tool, a less costely for the public coffers and that allows the confirmation of the clinical condition reported by the doctor. This study proposes the detection and quantification of Mycobacterium leprae in the different components of peripheral whole blood through realtime Polymerase Chain Reaction (qPCR). The study population consisted of leprosy suspected patients, treated at the University Hospital of Brasília, during the one-year period between June 2000 and June 2021, totaling 111 patients, of which 55 were positively diagnosed and 56 were controls. After obtaining the serum, plasma, red blood cells and peripheral blood mononuclear cells, they were subjected to DNA extraction using a commercial Purelink Genomic kit from Thermofisher. For the standarization of the positive controls and the reaction of the quantification standard curve, the RLEP genetic target of the mycobacterial genome was made. The qPCR was performed qualitatively and quantitatively using the primers RLEPBR F -5’ – CTTGCACCATTTCTGCCGCT – 3’ e RLEPBR R – 5’ – TGCGCTAGAAGGTTGCCGTA – 3’. Of the participants clinically diagnosed with leprosy, 52,73% were female, the average age was 44.33 years and none were household contacts. Of the control participants, 50% were male, the average age was 45.11 and 48 were household contacts. By the classification of the clinical condition, 1 participant was indeterminate, 5 were tuberculoid, 8 borderline-tuberculoid, 18 borderline, 11 borderline-lepromatous and 12 lepromatous. As for the disability degree, 17 were classified as degree 1, 15 patients as degree 2 and 23 with none degree. As for the biomolecular results, the sensitivity was low corresponding to 11.54% in serum, 7.31% in plasma, 9.26% in peripheral blood mononuclear cells, 9.80% in red blood cells and 38.18% in smear microscopy. Among paucibacillary patients, the highest sensitivity was found in both serum and red blood cells and among multibacillary patients the highest sensitivity was found in serum. The low sensitivity found in the results suggests that peripheral blood is not a consistent material for diagnosing leprosy