The ω-Amidase/NIT2 is a novel redox-sensitive key regulator of glutamine metabolism in endothelial cells

Oxidative stress is thought to be a driver for several diseases. However, many data to support this concept were obtained by the addition of extracellular H2O2 to cells. This does not reflect the dynamics of intracellular redox modifications. Cells actively control their redox-state, and increased formation of ROS is a response to cellular stress situations such as chronic inflammation. In this study, it was shown that different types of ROS lead to different metabolic and transcriptomic responses of HUVECs. While 300 μM extracellular H2O2 led to substantial metabolic and transcriptomic changes, the effects of DAO-derived H2O2 and menadione were low to moderate, indicating that the source and the concentration of ROS are important in eliciting changes in metabolism and gene expression. Specifically, it was identified that acute increases in ROS transiently inactivate the enzyme ω-amidase/NIT2 of the glutaminase II pathway, which supplies cells with anaplerotic α-ketoglutarate. The pathway has not been studied systematically because, as noted above, the major intermediate, KGM, is not commercially available. In the present study, an internal standard for targeted detection of KGM in cells and blood plasma/serum was used. Deletion of NIT2 by CRISPR/Cas9 significantly reduced α-ketoglutarate levels in HUVECs and elevated KGM levels. It appears that in cell culture conditions, hydrolysis of KGM to α-ketoglutarate is very efficient. Knockout of the glutamine transaminases significantly reduced methionine, suggesting that the glutaminase II pathway is an important source of amino acid replenishment. Similar to genetic silencing of GLS1 [91,92], HUVECs lacking NIT2 showed reduced proliferation and angiogenic sprouting. Furthermore, our results indicate that, at least in HUVECs, the enzyme also locates in the mitochondria where it interacts with key enzymes of glutamine/glutamate/α-ketoglutarate metabolism. The data of the present work indicate that the glutaminase II pathway is an underappreciated, redox-sensitive pathway for glutamine utilization in HUVECs. Genetic deletion of NIT2 has considerable physiological effects highlighting the importance of glutamine for ECs.Der Begriff reaktive Sauerstoffspezies umfasst freie Radikale wie Superoxidanionen (O2●-), Hydroxylradikale (HO●) und stabile molekulare Oxidantien wie Wasserstoffperoxid (H2O2). Sie entstehen im Rahmen normaler Stoffwechselvorgänge in den verschiedenen Zellkompartimenten wie dem Zytoplasma, den Mitochondrien oder an der Zellmembran. Superoxidanionen werden als Nebenprodukt der Zellatmung (Komplexe I und III) sowie durch Lipoxygenasen oder Xanthinoxidasen generiert. Aufgrund ihrer negativen Ladung können sie die Plasmamembran nicht passieren und reagieren langsam und wenig selektiv. Innerhalb der Zelle wird Superoxid durch das Enzym Superoxid-Dismutase zu H2O2 abgebaut. Die physiologische intrazelluläre H2O2 Konzentration liegt zwischen 1 und 10 nM. Im Vergleich zu Superoxid- und Hydroxylradikalen hat H2O2 innerhalb der Zelle eine relativ lange Lebensdauer (~10 s). Jahrzehntelang wurden reaktive Sauerstoffspezies als schädliche Nebenprodukte des zellulären aeroben Stoffwechsels eingestuft, da sie in der Lage sind, die DNS, Lipide oder Proteine zu oxidieren. Hiermit assoziiert ist das Konzept des oxidativen Stresses, der eine Stoffwechsellage bezeichnet, in der die Zelle durch reaktive Sauerstoffspezies geschädigt wird. Er gilt als zentrales Merkmal verschiedener Krankheiten wie Krebs oder Atherosklerose. Diese Vorstellung änderte sich mit der Beobachtung, dass exogenes H2O2 die Aktivität von Wachstumsfaktoren imitieren kann. Heutzutage wird angenommen, dass reaktive Sauerstoffspezies in geringen Konzentrationen eine wichtige Signalfunktion haben, wohingegen hohe Konzentrationen als krankheitsfördernd eingestuft werden. Den Zellen stehen verschiedene Schutzmechanismen zur Verfügung, um die negativen Auswirkungen akuten oxidativen Stresses zu reduzieren. Einerseits existiert ein antioxidatives Schutzsystem, das aus enzymatischen und nicht-enzymatischen Radikalfängern besteht, andererseits existieren Reparaturmechanismen zum Schutz der DNS sowie die Möglichkeit zum gezielten Abbau von geschädigten Proteinen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich primär mit dem Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies auf den Metabolismus von Endothelzellen, die die innerste Zellschicht der Blutgefäße bilden. Von besonderer wissenschaftlicher Bedeutung ist hier, dass die metabolische und transkriptionelle Antwort von Endothelzellen auf verschiedene Arten und Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies noch nicht vollständig erforscht ist. Bisher fehlten geeignete Ansätze, um die Effekte der intrazellulären Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies besser zu verstehen. Dieses Verständnis ist aber essentiell, da viele Schlussfolgerungen über die biologische Rolle von H2O2 im Zusammenhang mit der Signaltransduktion durch die Zugabe von extrazellulärem H2O2 getroffen wurden. Dies spiegelt jedoch nicht die Dynamik des intrazellulären H2O2-Flusses bei der Regulierung der Signaltransduktion wider. Um die metabolischen und transkriptionellen Auswirkungen von intrazellulär produziertem H2O2 mit anderen Arten von reaktiven Sauerstoffspezies zu vergleichen, wurde ein enzymatischer Ansatz zur Produktion von intrazellulärem H2O2 gewählt. Dieser Ansatz basiert auf der Überexpression des Enzymes D-Aminosäure-Oxidase (DAO) in Endothelzellen. Das Enzym wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und oxidiert D-Aminosäuren zu ihren entsprechenden Iminosäuren und H2O2. Das Imin wird dann nicht-enzymatisch zu seiner entsprechenden α-Ketosäure hydrolysiert. DAO ist stereospezifisch für D-Aminosäuren (z. B. D-Alanin). Daher ermöglicht die Zugabe von D-Aminosäuren zu Zellen, die DAO exprimieren, die kontrollierte Produktion von intrazellulärem H2O2. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die lentivirale Überexpression der DAO in Nabelschnurendothelzellen etabliert. Dieser Ansatz wurde anschließend molekularbiologisch charakterisiert: Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von D-Alanin intrazelluläres H2O2 generiert, welches spezifische Redox-Proteine (bspw. Peroxiredoxine) oxidiert. Im Anschluss wurde dieses Modell genutzt, um die zeitabhängige metabolische und transkriptionelle Antwort von Nabelschnurendothelzellen auf intrazellulär-generiertes H2O2 (durch die Stimulation mit 3 mM D-Alanin) im Vergleich zu extrazellulär hinzugefügtem H2O2 (10 μM und 300 μM) und intrazellulär-generiertem Superoxid (durch die Zugabe von Menadion) zu untersuchen. In diesem Rahmen wurde das metabolische Profil der Zellen mithilfe moderner (ungerichteter) Massenspektrometrie zu verschiedenen Stimulationszeitpunkten analysiert. Weiterhin wurde die RNS der Proben sequenziert, um die zeitabhängigen transkriptionellen Veränderungen zu detektieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass unterschiedliche reaktive Sauerstoffspezies in Abhängigkeit von ihrem Entstehungsort und ihrer Konzentration unterschiedliche Effekte auf die Genexpression und den Stoffwechsel von Endothelzellen haben. Während 300 μM extrazelluläres H2O2 zu einer starken metabolischen und transkriptionellen Antwort führte, sind die Auswirkungen von intrazellulär-produziertem H2O2 und Superoxidanionen vor allem auf Genexpressionsebene detektierbar. Die unterschiedlichen reaktiven Sauerstoffspezies beeinflussten vor allem die Expression ribosomaler RNS. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass einerseits die Lokalisation als auch die Konzentration von reaktiven Sauerstoffspezies von erheblicher Bedeutung für ihre biologischen Effekte sind ..