The effect of chemotherapy on translation and tRNA modifications in colon carcinoma

Paksusuolen syöpä on maailman kolmanneksi yleisin syöpä. Vuonna 2020 se aiheutti lähes miljoona kuolemantapausta. Merkittävin syy kuolemantapauksiin on syövän kehittyminen resistentiksi eli vastustuskykyiseksi hoidoille, ja tästä syystä levinnyt paksusuolen syöpä on usein parantumaton. Hoitoresistenssi koskee muitakin syöpätyyppejä kuin paksusuolen syöpää, ja se onkin yksi suurimmista ongelmista kaikkien syöpien hoidossa. Syöpälääkeresistenssi on monen tekijän summa, jotka yhdessä mahdollistavat syöpäsolujen kasvun hoidoista huolimatta. Resistenssimekanismit voidaan jakaa kahteen luokkaan: solun ulkoisiin ja solun sisäisiin mekanismeihin. Solun ulkoiset mekanismit liittyvät kasvaimen mikroympäristöön. Solun sisäisiin mekanismeihin kuuluvat esimerkiksi lääkkeen tehokas uloskuljetus solusta, lääkkeen aiheuttamien vaurioiden korjaaminen sekä muutokset niiden geenien ilmentymisessä joiden tuotteisiin lääkkeen vaikutus kohdistuu. Viime aikoina tutkijoiden huomio on keskittynyt proteiinisynteesin merkitykseen resistenssin kehittymisessä. Stressin aikana solu vähentää proteiinisynteesin kokonaismäärää ja tuottaa valikoidusti niitä proteiineja, jotka ovat olennaisia solun selviytymisen kannalta. Proteiinisynteesiä säätelevät lukuisat mekanismit, joista yksi on siirtäjä-RNA-molekyylien (tRNA) toiminnan säätely kemiallisten muokkauksien avulla. Nämä muokkaukset ovat tRNA-molekyyleihin kiinnittyviä kemiallisia ryhmiä. Ne vaikuttavat kantajamolekyylinsä rakenteeseen ja vakauteen sekä toimintaominaisuuksiin, kuten lukukehyksen säilyttämiseen, emäspariperiaatteen joustavuuteen ja translaation nopeuteen. tRNA:iden kemialliset muokkaukset ovat dynaamisia; ne reagoivat solun tilassa tapahtuviin muutoksiin ja osaltaan mahdollistavat solun sopeutumisen stressitilaan translaatiota säätelemällä. Näin ollen on syytä uskoa, että tRNA:iden kemialliset muokkaukset sekä muut translaatioon liittyvät säätelymekanismit osallistuvat solun kemoterapiavasteeseen ja kemoresistenssin kehittymiseen. Tässä tutkielmassa selvitettiin kemoterapia-altistuksen vaikutusta translaatioon ja tRNA:iden kemiallisiin muokkauksiin käyttäen mallina paksusuolen syöpää. Solulinjat SW480 (primäärisestä paksusuolen kasvaimesta) ja SW620 (metastaasista) altistettiin 5-fluorourasiilille, oksaliplatiinille ja leukovoriinille (FOLFOX), joka on yleisesti paksusuolisyövän hoidossa käytettävä solunsalpaajayhdistelmä. Altistus toteutettiin sekä pitkäaikaisena että lyhytaikaisena (24 tuntia). Pitkäaikainen altistus toteutettiin myös kasvattamalla solunsalpaajien pitoisuuksia joka hoitojaksolla; näin luotiin kemoresistenttejä solulinjoja. Muutoksia translaatiossa analysoitiin käyttäen polysomiprofilointia. Lyhytaikainen altistus aiheutti välitöntä translationaalista stressiä: polysomiprofiileissa havaittiin viitteitä siitä, että ribosomien 60S alayksiköiden kiinnittyminen translaatiokompleksiin oli estynyt. Pitkäaikainen altistus ei aiheuttanut muutoksia polysomiprofiileissa, mikä mahdollisesti tarkoittaa solujen sopeutuneen altistukseen. Kemoresistenteilla soluilla translaatioaktiivisuus oli hieman vähäisempää kontrolliin verrattuna. Tämä saattoi johtua 5-fluorourasiilin vaikutuksesta ribosomien toimintaan. Muutoksia tRNA:iden kemiallisissa muokkauksissa analysoitiin nestekromatografia-massaspektometrialla. Lyhytaikainen kemoterapia-altistus aiheutti muutoksia tiettyjen kemiallisten muokkausten määrissä kontrolliin verrattuna. Lisäksi 5-fluorouridiinia, 5-fluorourasiilin metaboliittia, löytyi tRNA-näytteistä lyhytaikaisen altistuksen jälkeen. Pitkäaikainen altistus ei aiheuttanut muutoksia kemiallisten muokkausten tasoissa. Tiivistettynä, tämän tutkielman tulokset valottavat FOLFOX-kemoterapian välitöntä vaikutusta translaatioon ja tRNA:iden kemiallisiin muokkauksiin. Tämä on ensimmäinen askel kohti RNA-pohjaisten säätelymekanismien merkityksen ymmärtämistä kemoterapiavasteessa ja -resistenssissä.Colorectal cancer is one of the most common cancers in the world, and in 2020 it was the cause of nearly 1 million deaths. A major reason for the high death rate is treatment resistance; eventually, almost all colorectal cancer patients with metastatic disease stop responding to chemotherapy. The problem of treatment resistance is not specific to this type of cancer, but it is a widespread issue for all cancer treatments. Chemotherapy resistance is the sum of several cellular and non-cellular factors that together enable sustained cell growth despite the treatment. The non-cellular factors are related to the tumor microenvironment, whereas the cellular factors are related to changes in gene expression, which facilitate e.g. the repair of drug-induced damage or lead to changes in drug metabolism. Lately, researchers have turned their interest to translational control in chemotherapy resistance. This is because translational control plays a major role in stress adaptation. During cellular stress, global translation rates are reduced and those messenger RNAs that are most important for cell survival are translated efficiently. Moreover, translation is fine-tuned by transfer RNA (tRNA) modifications. These modifications are chemical groups that are added to the ribose and the nucleobase of the tRNA molecule, and they affect all aspects of tRNA function, ranging from the structure and stability of the molecule to reading frame maintenance and rate of translation. tRNA modifications are dynamic and change in response to the cellular state, thus facilitating adaptation by translational control. Given the major role of translational control and tRNA modifications in cellular stress responses, their role in the chemotherapy response and adaptation should be thoroughly investigated. The aim of this thesis was to study how chemotherapy affects translation and tRNA modifications in a colon adenocarcinoma model. The cell lines SW480 (from a primary colorectal tumor) and SW620 (from a metastasis) were treated with 5-fluorouracil, oxaliplatin, and leucovorin (FOLFOX), a common combination of chemotherapeutics used in colorectal cancer treatment. The cells were subjected to long-term cyclic treatment as well as 24 h pulse treatment. Chemotherapy resistant cell lines were established by increasing the concentration of FOLFOX for each round of treatment. The effect on translation was studied by polysome profiling, which revealed that FOLFOX treatment causes immediate translational stress, as evidenced by the “shoulders” in the polysomal fractions in the profiles of the pulse treated cells. We hypothesized that these shoulders represent halfmers, polyribosomes without the large subunit. No difference was observed between the long-term treated cells and controls, possibly indicating that the cells had adapted to FOLFOX. The resistant cells exhibited slightly reduced translational activity, which might be due to altered function of ribosomes following the exposure to 5-fluorouracil. Changes in tRNA modification levels were quantified by liquid chromatography mass spectrometry. Several anticodon loop modifications exhibited altered levels after the pulse treatment. In addition, 5-FUrd, a metabolite of 5-fluorouracil, was incorporated into the tRNA. The long-term treated or resistant cells exhibited no differences in the modification levels. In conclusion, this study provided insights on the immediate effects of FOLFOX treatment on translation. This constitutes the first step towards understanding how RNA-based regulatory mechanisms may contribute to the effect and possible resistance to chemotherapy