Multicomponent nanoplatform as a vaccine against brain tumors

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Os tumores situados no sistema nervoso central (CNS) são a principal causa de morte de cancro entre crianças e adolescentes, sendo o glioblastoma multiforme o mais comum, com uma taxa de sobrevivência de apenas 5% após o seu diagnóstico. Além disso, as células tumorais de outros tumores primários, como por exemplo células de melanoma, conseguem ainda escapar e metastizar para outros órgãos, incluindo o cérebro. Uma vez o tumor presente no cérebro, o prognóstico associado é baixo, com uma esperança de vida até 14 meses. O tratamento tradicional baseia-se na cirurgia mas, devido à localização destes tumores, a sua completa remoção é muito difícil e a radioterapia e a quimioterapia tendem a provocar tolerância e recorrência de células tumorais. Assim sendo, há uma grande urgência em desenvolver terapias mais eficazes e específicas para tumores cerebrais. A iniciação e a progressão do cancro reflete um conjunto de mutações no mecanismo de reparo do DNA e ainda de alterações epigenéticas. Pensa-se que seja o conjunto destes dois tipos de anomalias que permita às células tumorais crescerem, sem que o sistema imunitário consiga impedi-las. Devido às alterações genéticas, as células tumorais apresentam uma elevada taxa de proliferação. Quando a quantidade de oxigénio e nutrientes é insuficiente para assegurar o seu crescimento, as células tumorais libertam fatores induzidos por hipóxia (HIFs) que induzem uma angiogénese patológica. Durante este processo, a migração das células imunitárias diminui, enquanto que as células imunossupressoras se acumulam no microambiente tumoral. Além disso, as células tumorais também conseguem regular os mecanismos de resistência à apoptose e ainda inibir a atividade das células T que foram previamente ativadas. Todas estas estratégias utilizadas pelas células tumorais fazem com que haja um menor número de células imunitárias capazes de eliminar as células tumorais, assim como uma própria diminuição da atividade anti-tumoral destas. Como consequência, as células tumorais conseguem fugir ao controlo das células imunitárias, permitindo que continuem a proliferar e a metastizar para outros órgãos. Uma terapia que tem vindo a ser utilizada é a imunoterapia activa, pois tem a capacidade de (re) ativar a capacidade do sistema imunológico do hospedeiro em reconhecer os antigénios associados a tumores (TAAs) e assim, desenvolver uma resposta específica e eficaz. As células dendríticas (DCs) são consideradas células apresentadoras de antigénios (APC) profissionais capazes de estimular células T, as quais são fundamentais no desenvolvimento de uma resposta imune. As DCs imaturas localizadas nos tecidos periféricos atuam como sentinelas. Elas sofrem maturação em resposta a diferentes estímulos que incluem componentes microbianos, tumorais e danos nos tecidos periféricos, promovendo a sua migração para os nódulos linfáticos (LN). Aqui, as DCs regulam a expressão de moléculas co-estimulatórias e dos complexos péptidos-moléculas do complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II, levando à estimulação das células T específicas para esse antigénio. Uma resposta citótóxica específica contra as células tumorais que expressam esse antigénio é depois induzida após a ativação destas células T e a sua subsequente diferenciação em linfócitos T citotóxicos (CTLs) e linfócitos T auxiliares (Th). A utilização de nanopartículas (NPs) é uma das estratégias utilizadas para prevenir a eliminação de antigénios e outras moléculas capazes de aumentar a resposta imunitária (adjuvantes). No presente trabalho utilizaram-se NPs poliméricas biodegradáveis tendo em conta as seguintes vantagens: i) possível alteração da sua superfície para que se promova o transporte de moléculas ativadoras do sistema imunológico para as APCs, bem como a libertação controlada dos mesmos, reduzindo assim a sua frequência de administração; ii) aumentam a solubilidade das moléculas insolúveis em água; iii) são biocompatíveis uma vez que os produtos resultantes da sua degradação são o ácido lático e o glicólico, os quais são substrato do ciclo de Krebs, apresentando por isso baixa toxicidade. Estas NPs são portanto internalizadas por APC, sendo os péptidos libertados nos compartimentos intracelulares ou no citosol destas, permitindo o processamento e posterior apresentação dos antigénios por diferentes vias de sinalização, o que resultará numa extensa resposta imunológica. O revestimento destas nanovacinas pelo polietilenoglicol (PEG) previne a eliminação destas do organismo antes que cheguem às APCs. Trata-se de um polímero hidrofilíco que reduz as interações entre as NPs e as biomoléculas presentes no sangue ou no líquido intersticial, o que faz com que o tempo de semi-vida destas aumente. Além disso, para assegurar que as NPs são fagocitadas especificamente pelas APCs, a superfície das NPs pode ser conjugada com ligandos de receptores presentes nessas células fagocitárias. Os receptores de lectina, por exemplo, aumentam o reconhecimento e internalização destas NPs, promovendo o processamento de antigénios. As NPs desenvolvidas neste trabalho foram funcionalizadas com manose, a qual se liga aos receptores CD206. Assim, com esta estratégia asseguramos que, além de as NPs serem específicas para as APCs, promoveremos a sua entrada mediada por receptores, pelo que se reforçará o possível processamento de antigénios por múltiplas vias, incluindo a sua libertação preferencial no citosol. Assim, estes epitopos serão apresentados após a sua conjugação com as moléculas MHC classe I (apresentação cruzada), o que levará à ativação das CTL. Estas NPs foram preparadas com uma mistura de polímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido láctico-co-glicólico)-poli(etilenoglicol) (PLA/PLGA-PEG) (80:20), PLGA-PEG, PLA/PLGA (80:20) PLA/PLGA-PEG-Manose (80:20) e PLA/PLGA-Manose (80:20). Todas as partículas foram produzidas com poli(álcool vinílico) (PVA) na fase interna, vitamina E d-α-tocoferil polietilenoglicol 1000 succinato (TPGS) na fase externa e com PVA ou Pluronic (PF-127) na fase final, pelo método de dupla emulsão. Primeiramente, o agente tensioativo ou estabilizador PVA previamente dissolvido na fase aquosa é misturado com o polímero dissolvido numa fase orgânica. Após a formação da primeira emulsão (o/w1), um segundo agente tensioativo (TPGS) é misturado, originando uma segunda emulsão. A dupla emulsão resultante (w1/o/w2) é adicionada a uma fase aquosa de PVA ou PF-127, e é agitada durante uma hora até o solvente orgânico evaporar. De seguida, as partículas são centrifugadas duas vezes para remover o excesso de tensioativo e no final, resuspendidas em PBS pH 7.4. Procedeu-se à caracterização das propriedades físico-quimicas destas NPs, como o diâmetro médio, a distribuição de diâmetros médios, carga à superfície e morfologia das NPs constituídas por PLGA-PEG, PLA/PLGA-PEG e PLA/PLGA-PEG-Manose. Todas estas NPs mostraram terem características que lhes permitem ser internalizadas pelas DCs, com um tamanho inferior a 200nm e com uma morfologia esférica. Porém, apresentaram uma carga superficial negativa. Estas NPs mostraram não alterar a viabilidade da linha celular de células dendríticas imaturas (JAWSII), quando incubadas numa concentração até 1 mg/mL. Estas NPs foram internalizadas pelas DCs in vitro, ainda que com diferentes taxas de internalização, sendo a NP composta por PLGA-PEG a menos internalizada. A segunda parte deste projecto de investigação consistiu em investigar de que modo o revestimento das NPs com PEG interfere na internalização e maturação das DCs in vivo. Com base nos dados anteriormente obtidos, produziram-se NPs com PLA, nomeadamente PLA/PLGA, PLA/PLGA-Manose e PLA/PLGA-PEG-Manose. Novamente procedeu-se à sua caracterização físico-química tanto de NPs vazias (sem antigénio e adjuvantes) como de NPs contendo os adjuvantes oligodeoxinucleótidos de CpG não metilados (Cpg) e ácido poliinossínico:policictílico (Poly (I:C)), e neo-antigénios expressos em células tumorais de melanoma e glioblastoma. Todas as NPs produzidas apresentaram propriedades físico-químicas adequadas para a sua internalização pelas DCs, com tamanho médio perto de 200 nm e distribuição estreita de tamanho de partícula. Todas as NPs incorporaram quantidades de neo-antigénios de glioblastoma ou melanoma, e dos adjuvantes CpG e Poly (I:C) adequadas às necessárias para a atividade biológica pretendida. Assim sendo, estas NPs reúnem as características que prevêm a sua utilização na estimulação de uma resposta imune forte e duradoura especificamente induzida contra estes tumores cerebrais. Quando estudada a internalização das NPs e ativação das DCs in vivo, todas as NPs foram mais internalizadas por DC migratórias. Todas as NPs induziram com sucesso a maturação das DC migratórias, com o aumento da expressão das moléculas co-estimulatórias MHC que são essenciais para a apresentação de antigénios e ativação das células T.Vaccination is a promising strategy to trigger and boost immune responses against cancer. Biodegradable polymeric nanoparticles (NPs) are promising vaccine delivery systems due to their capacity to entrap antigens and immunoadjuvants, allowing for their sustained release over time, protection from in vivo degradation, while ensuring specific targeting of antigen-presenting cells (APCs). We have synthesized and characterized aliphatic-polyester (poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) NPs co-entrapping CpG oligodeoxynucleotides (CpG) and polyinosinic:polycytidylic acid (Poly (I:C)) adjuvants with neo-antigens expressed in melanoma and glioblastoma tumor cells to investigate the impact of nanoparticles’ properties in the activation and subsequent maturation of APCs, namely dendritic cells (DCs), aiming at the generation of antigen-specific immune responses in primary and metastatic brain tumors. Several types of NPs were produced – non-targeted poly(lactic acid)/poly(lactic-co-glycolic acid)-pol(ethylene glycol) (PLA/PLGA-PEG), PLA/PLGA and PLGA-PEG NP, or targeted PLA/PLGA-PEG-Mannose and PLA/PLGA-Mannose NPs, to improve NP targeting and internalization by APCs. All NPs had physicochemical properties adequate for DC targeting, with an average size below 200 nm and narrow particle size distribution. PLA/PLGA-PEG and PLA/PLGA-PEG-Mannose NPs presented lower mean diameters and higher DC internalization values than those obtained for PLGA-PEG NPs. Independently of NP composition, all PLGA-PEG, PLA/PLGA-PEG and PLA/PLGA-PEG-Mannose NPs revealed to be non-toxic to immature DCs line, with cell viability higher than 80%. Due to the advantages of PLA-based NPs and the role that PF-127 may have, it was investigated the impact of different polymers (PLA/PLGA, PLA/PLGA-Mannose and PLA/PLGA-PEG-Mannose) and surfactants (PVA and PF-127), on DC internalization and maturation. All NPs efficiently entrapped glioblastoma and metastatic melanoma neo-antigens with CpG and Poly (I:C) and were preferentially internalized by migratory DCs. NPs containing the combination of neo-antigen expressed in glioblastoma or melanoma with adjuvants, successfully induced the maturation of migratory DCs, with increased expression of costimulatory and MHC molecules that are essential for antigen presentation and activation of naive T cellsCom o patrocínio do iMM, FCUL; IGC, FCT, Ineti, Tel Aviv university