Novel p53 activators for anticancer therapy

Tese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaA proteína p53 supressora de tumores é conhecida como a "guardiã do genoma". É responsável pela integridade das células, estando envolvida no processo de interrupção do ciclo celular de células com genoma modificado, apoptose, senescência, diferenciação e reparação do ADN. A mutação da p53 (p53mut) ocorre em aproximadamente 50% dos cancros humanos, enquanto que nos restantes 50% a p53 de tipo selvagem se encontra inibida devido a ligação aos seus principais reguladores negativos (MDM2/MDMX). Por esta razão, existe um grande interesse na reativação desta proteína de modo a que ela possa exercer a sua função supressora nas células tumorais. Nos últimos anos, o nosso grupo de investigação tem estado envolvido no desenvolvimento de novos ativadores da p53. Em particular, a família das spiropirazolinas surgiu como uma classe extremamente promissora com atividade antiproliferativa em linhas celulares de cancro que expressam proteína p53 do tipo selvagem, daí o interesse em otimizar esta estrutura. No entanto, a posição do azoto do oxindole permanecia até aqui inexplorada. Nesta tese de Mestrado, foi sintetizada uma nova biblioteca de derivados das spiropirazolinas substituídos no azoto do oxindole. Doze novos derivados foram sintetizados com rendimentos de reacção que variam entre 21 e 96%. Foi também avaliada a atividade antiproliferativa da biblioteca sintetizada contra as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDAMB-231 e esta foi comparada com a do composto protótipo (hit – sem substituintes). Quatro compostos mostraram atividade antiproliferativa com valores de IC50 (MCF-7) entre 9,3 e 34,9 μM. Para dois destes compostos, foi alcançada uma melhor atividade e seletividade para a linha celular MCF-7, quando comparado com o composto hit. Além disso, foram realizados estudos de estabilidade em PBS e plasma humano para alguns dos compostos promissores, tendo-se observado que o composto substituído com um grupo propanol e o composto hit são estáveis nestes meios. Por outro lado, o interesse em compostos híbridos levou-nos a sintetizar quatro novas moléculas contendo a spiropirazolina como um dos farmacóforos. Nesta estratégia, dois farmacóforos distintos que actuam independentemente em dois alvos distintos ou no mesmo alvo mas através de mecanismos de ação diferentes, estão covalentemente ligados numa molécula única diretamente ou através de um espaçador. Este tipo de moléculas demonstrou um potencial promissor, uma vez que permitem contornar o desenvolvimento de resistência aos fármacos. Além disso, ao combinar dois fármacos na mesma molécula, é possível maximizar a sua potência e/ou diminuir os efeitos secundários quando comparados com os fármacos isolados. Duas destas novas moléculas contem como segundo farmacóforo um agente alquilante de ADN (triazeno). Nos outros dois novos híbridos, foi utilizado um outro ativador da p53 (SLMP53-1), que atua de forma distinta na via da p53. As quatro moléculas sintetizadas foram obtidas com rendimentos entre 37 e 91%. Estas foram também avaliadas pela sua atividade antiproliferativa em várias linhas de cancro (linhas celulares MCF-7 e MDA-MB-231 de cancro da mama, A375 de melanoma humano, B16F10 de melanoma murino, CT26 de cancro do cólon, HCT-116 cancro de cólon humano e HaCat queratinócitos humanos). Nenhum dos híbridos sintetizados mostrou atividade antiproliferativa contra as linhas celulares testadas. Um dos compostos usados como intermediários de síntese foi também testado e mostrou um ligeiro melhoramento na atividade antiproliferativa contra a linha de cancro da mama MCF-7 quando comparado ao composto hit. Foram obtidos melhores valores de IC50 para uma mistura da spiropirazolina com o triazeno, quando comparados aos valores do uso dos dois farmacóforos individuais, indicando um possível efeito sinérgico entre os dois farmacóforos.p53 is a tumor suppressor protein known as the “guardian of the genome”. It is responsible for the integrity of the cells, being involved in the process of interrupting cell cycle of damaged cells, apoptosis, senescence, differentiation and DNA repair. Mutation (mut) in p53 gene occurs in approximately 50% of human cancers, while in the remaining 50% wild-type (wt) p53 is inhibited by its main negative regulators (MDM2/MDMX). For this reason, there is a high interest in the reactivation of this protein in order to exert its tumor suppressor function in tumor cells. In recent years, our research group has been involved in the development of novel p53 activators. In particular, the spiropyrazoline oxindole scaffold has shown interesting antiproliferative activities in cancer cell lines expressing wild-type p53. Specificaly, one spiropyrazoline oxindole emerged due to antiproliferative activity in MCF-7 breast, HCT-116 human colon, and A2780 ovarian cancer cell lines. This compound induces apoptosis and cell cycle arrest, upregulates p53 steadystate levels, decreases MDM2 levels and have low cytotoxicity in normal cells. However, the position of the oxindole nitrogen still unexplored until now. In this Master’s thesis, in order to explore the nitrogen position of the oxindole, a novel library of N-substituted spiropyrazoline oxindole derivatives was prepared based on a hit compound previoulsy identified by our research group. Twelve N-substituted spiropyrazoline oxindole derivatives were synthesized in low to high yields (21-96%). The activity of the novel derivatives was evaluated against breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231). Four compounds showed antiproliferative activity against MCF-7 with IC50 values between 9.3 and 34.9 μM. For two of these compounds, a better activity and selectivity for MCF-7 cell line was achieved when compared to the hit compound (NH-spiropyrazoline oxindole core). In addition, stability studies in PBS and human plasma were performed for some promising compounds, showing that compound containing a propanol chain and the hit compound are very stable in both media. A complementary aim of the thesis was the synthesis of hybrid compounds based in the spiropyrazoline oxindole pharmacophore. In this approach, two distinct pharmacophores that independently act at two distinct pharmacological targets or by different mechanisms of action are covalently linked in one unique molecule. Due to this property, these types of molecules have shown promising potential as they allow circumventing the development of drug resistance. Furthermore, by combining two drugs in the same unique molecule, it is possible to maximize their potency and circumvent some drawbacks of the single drugs. Four hybrids were synthesized, two of these hybrids contained as second pharmacophore a DNA alkylating agent (triazene moiety), while the two other hybrids contained another p53 activator (SLMP53-1) which acts as a wt and mut p53 activator. The four hybrids were obtained in medium to high yields (37-91%) and their antiproliferative activity was evaluated in diverse cancer cell lines (MCF-7 breast, MDA-MB-231 breast, A375 human melanoma, B16F10 murine melanoma, CT26 colon carcinoma, HaCat human keratinocytes and HCT116 human colon cancer cell lines). None of the hybrids showed antiproliferative activity against cancer cell lines. One intermediate showed a slight improvement of the activity in MCF-7 cells compared to the hit compound. IC50 values of a mixture of spiropyrazoline oxindole and triazene indicate a possible synergistic effect between the two pharmacophores.Com o patrocínio do Medicinal Organic Chemistry Group, Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa)